大腸埃希菌多重耐藥外排泵AcrAB-Tolc主動(dòng)外排機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的:大腸埃希菌是當(dāng)今社區(qū)感染及院內(nèi)感染最常見的病原菌之一，是威脅人類健康的重要致病菌。隨著抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用及抗生素的升級(jí)換代，細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥越來越嚴(yán)重。臨床上多重耐藥大腸埃希菌的出現(xiàn)和播散，嚴(yán)重影響了治療效果，增加了治療成本。對(duì)多重耐藥大腸埃希菌的治療是臨床上非常重要的目標(biāo)。細(xì)菌的耐藥機(jī)制包括產(chǎn)生滅活酶、改變藥物作用靶位、改變外膜通透性、主動(dòng)外排作用，產(chǎn)生生物膜等。其中后三種機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥的最主要機(jī)制。阻止藥物

2、在菌體內(nèi)聚集是細(xì)菌產(chǎn)生抗生素多重耐藥的重要手段之一，由細(xì)菌的主動(dòng)外排系統(tǒng)介導(dǎo)。大腸埃希菌的細(xì)胞外膜上存在多種外排系統(tǒng)可泵出多種結(jié)構(gòu)無關(guān)的化合物，AcrAB-TolC外排泵是其中最主要的占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的多重藥物外排泵，底物廣泛，研究天津地區(qū)大腸埃希菌外排泵AcrAB-TolC在臨床株中的攜帶情況、與耐藥的相關(guān)性，及羰基氰氯苯腙(CCCP)對(duì)大腸埃希菌外排泵AcrAB-TolC的抑制作用，為臨床多重耐藥大腸埃希菌感染的防治探索可能的、新的思路。

3、
　　 研究方法:
　　 1、菌株的收集、鑒定:收集2008年7月至2009年7月期間天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院臨床分離的大腸埃希菌90株，剔除同一病例相同部位重復(fù)菌株，所有菌株采用常規(guī)生化鑒定。大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922作為質(zhì)量控制菌株，金黃色葡萄球菌ATCC25923為acra/acrb基因陰性對(duì)照菌株，這兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株均為天津市感染性疾病研究所保存菌株。
　　 2、耐藥模式分組:采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定9

4、0株大腸埃希菌臨床株對(duì)6種抗菌藥物（氨曲南、頭孢噻肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、阿米卡星）的敏感性，藥敏結(jié)果依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI2011)判定標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)耐藥模式分為多重耐藥組、雙藥耐藥組、單藥耐藥組、全敏感組。
　　 3、外排泵基因acra/acrb基因的擴(kuò)增:應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增90株臨床分離的大腸埃希菌acra/acrb基因片段，PCR產(chǎn)物送北京華大科技有限公司進(jìn)行正負(fù)雙向DNA序列分析

5、。
　　 4、CCCP抑制實(shí)驗(yàn):選取10株多重耐藥大腸埃希菌進(jìn)行CCCP抑制實(shí)驗(yàn)，采取微量肉湯稀釋法測(cè)定加泵抑制劑CCCP（終濃度為100umol/L）前后多重耐藥菌株對(duì)5種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)。
　　 結(jié)果:
　　 1、共收集大腸埃希菌90株，其中尿道分離菌37株，腸道分離菌36株，呼吸到分離菌5株，其它分泌物（血液、腹水等）分離菌株11株。
　　 2、體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果:90株大腸埃希菌

6、對(duì)6種抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，耐藥率由高到低為環(huán)丙沙星67％，左氧氟沙星61％，慶大霉素53％，頭孢噻肟50％，氨曲南20％，阿米卡星10％。耐藥模式以雙藥耐藥30株(33.3％)，多重耐藥26株(28.9％)為主，單藥耐藥22株(24.4％)，全敏感12株(13.3％)。
　　 3、acra/acrb基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果:90株臨床分離的大腸埃希菌中55株(61.1％)均可見567bp(acra)及516bp(ac

7、rb)的擴(kuò)增片段。金黃色葡萄球菌ATCC25923未見此擴(kuò)增片段。選取大腸埃希菌臨床株246acra基因擴(kuò)增產(chǎn)物及臨床株b716acrb基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行正負(fù)雙向DNA序列分析，測(cè)序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)行同源性對(duì)比后證實(shí):臨床株246，acra基因同源性為98％，臨床株b716，acrb基因同源性為99％。其中多重耐藥組22株acra陽(yáng)性(84.6％)，acrb21株陽(yáng)性(80.8％);雙藥耐藥組acra16株陽(yáng)性(53.3％

8、)，acrb17株陽(yáng)性(56.7％);單藥耐藥組acra12株陽(yáng)性(54.5％)，acrb13株陽(yáng)性(59.1％);全敏感組acra5株陽(yáng)性(41.7％)，acrb4株陽(yáng)性(33.3％)?？梢娡馀疟没騛cra/acrb基因在4種耐藥模式的大腸埃希菌臨床株中普遍存在，在多重耐藥組中陽(yáng)性率最高，分別為84.6％和80.8％。對(duì)多重耐藥組及全敏感組的acra基因及acrb基因陽(yáng)性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用x2檢驗(yàn)，acra基因P=0.017;

9、acrb基因P=0.009，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、CCCP抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果:10株多重耐藥的大腸埃希菌臨床株在應(yīng)用CCCP后，多數(shù)菌株對(duì)5種抗生素MIC均有不同程度的下降，能使絕大多數(shù)菌株恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感性。菌株1034對(duì)頭孢曲松的MIC最高下降倍數(shù)為128倍，菌株A620、C636、1034對(duì)5種抗生素均為耐藥變?yōu)槊舾?。而菌株B1581和菌株O對(duì)5種抗生素的MIC基本沒有改變。
　　 結(jié)論:
　　 1、

10、90株大腸埃希菌臨床株對(duì)6種抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，對(duì)氟喹諾酮類抗生素耐藥率較高，而對(duì)阿米卡星耐藥率較低;耐藥模式以雙藥耐藥和多重耐藥為主。
　　 2、外排泵基因acra/acrb基因在4種耐藥模式的大腸埃希菌臨床株中普遍存在，其中，在多重耐藥組中陽(yáng)性率最高分別為84.6％和80.8％，在全敏感組陽(yáng)性率最低分別為41.7％和33.3％。二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、多數(shù)細(xì)菌具有主動(dòng)外排作用，C