大腸埃希菌多重耐藥外排泵AcrAB-Tolc主動外排機制的研究.pdf

1、研究目的:大腸埃希菌是當今社區(qū)感染及院內感染最常見的病原菌之一，是威脅人類健康的重要致病菌。隨著抗生素在臨床上的廣泛應用及抗生素的升級換代，細菌對抗生素的耐藥越來越嚴重。臨床上多重耐藥大腸埃希菌的出現(xiàn)和播散，嚴重影響了治療效果，增加了治療成本。對多重耐藥大腸埃希菌的治療是臨床上非常重要的目標。細菌的耐藥機制包括產生滅活酶、改變藥物作用靶位、改變外膜通透性、主動外排作用，產生生物膜等。其中后三種機制是細菌產生多重耐藥的最主要機制。阻止藥物

2、在菌體內聚集是細菌產生抗生素多重耐藥的重要手段之一，由細菌的主動外排系統(tǒng)介導。大腸埃希菌的細胞外膜上存在多種外排系統(tǒng)可泵出多種結構無關的化合物，AcrAB-TolC外排泵是其中最主要的占絕對優(yōu)勢的多重藥物外排泵，底物廣泛，研究天津地區(qū)大腸埃希菌外排泵AcrAB-TolC在臨床株中的攜帶情況、與耐藥的相關性，及羰基氰氯苯腙(CCCP)對大腸埃希菌外排泵AcrAB-TolC的抑制作用，為臨床多重耐藥大腸埃希菌感染的防治探索可能的、新的思路。

3、
　　 研究方法:
　　 1、菌株的收集、鑒定:收集2008年7月至2009年7月期間天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院臨床分離的大腸埃希菌90株，剔除同一病例相同部位重復菌株，所有菌株采用常規(guī)生化鑒定。大腸埃希菌標準菌株ATCC25922作為質量控制菌株，金黃色葡萄球菌ATCC25923為acra/acrb基因陰性對照菌株，這兩種標準菌株均為天津市感染性疾病研究所保存菌株。
　　 2、耐藥模式分組:采用K-B紙片擴散法測定9

4、0株大腸埃希菌臨床株對6種抗菌藥物（氨曲南、頭孢噻肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、阿米卡星）的敏感性，藥敏結果依據美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI2011)判定標準，根據耐藥模式分為多重耐藥組、雙藥耐藥組、單藥耐藥組、全敏感組。
　　 3、外排泵基因acra/acrb基因的擴增:應用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增90株臨床分離的大腸埃希菌acra/acrb基因片段，PCR產物送北京華大科技有限公司進行正負雙向DNA序列分析

5、。
　　 4、CCCP抑制實驗:選取10株多重耐藥大腸埃希菌進行CCCP抑制實驗，采取微量肉湯稀釋法測定加泵抑制劑CCCP（終濃度為100umol/L）前后多重耐藥菌株對5種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)。
　　 結果:
　　 1、共收集大腸埃希菌90株，其中尿道分離菌37株，腸道分離菌36株，呼吸到分離菌5株，其它分泌物（血液、腹水等）分離菌株11株。
　　 2、體外藥物敏感實驗結果:90株大腸埃希菌

6、對6種抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，耐藥率由高到低為環(huán)丙沙星67％，左氧氟沙星61％，慶大霉素53％，頭孢噻肟50％，氨曲南20％，阿米卡星10％。耐藥模式以雙藥耐藥30株(33.3％)，多重耐藥26株(28.9％)為主，單藥耐藥22株(24.4％)，全敏感12株(13.3％)。
　　 3、acra/acrb基因PCR擴增及測序結果:90株臨床分離的大腸埃希菌中55株(61.1％)均可見567bp(acra)及516bp(ac

7、rb)的擴增片段。金黃色葡萄球菌ATCC25923未見此擴增片段。選取大腸埃希菌臨床株246acra基因擴增產物及臨床株b716acrb基因擴增產物進行正負雙向DNA序列分析，測序結果在GeneBank數(shù)據庫中經行同源性對比后證實:臨床株246，acra基因同源性為98％，臨床株b716，acrb基因同源性為99％。其中多重耐藥組22株acra陽性(84.6％)，acrb21株陽性(80.8％);雙藥耐藥組acra16株陽性(53.3％

8、)，acrb17株陽性(56.7％);單藥耐藥組acra12株陽性(54.5％)，acrb13株陽性(59.1％);全敏感組acra5株陽性(41.7％)，acrb4株陽性(33.3％)?？梢娡馀疟没騛cra/acrb基因在4種耐藥模式的大腸埃希菌臨床株中普遍存在，在多重耐藥組中陽性率最高，分別為84.6％和80.8％。對多重耐藥組及全敏感組的acra基因及acrb基因陽性率進行統(tǒng)計學分析，采用x2檢驗，acra基因P=0.017;

9、acrb基因P=0.009，結果具有統(tǒng)計學意義。
　　 4、CCCP抑制實驗結果:10株多重耐藥的大腸埃希菌臨床株在應用CCCP后，多數(shù)菌株對5種抗生素MIC均有不同程度的下降，能使絕大多數(shù)菌株恢復對抗生素的敏感性。菌株1034對頭孢曲松的MIC最高下降倍數(shù)為128倍，菌株A620、C636、1034對5種抗生素均為耐藥變?yōu)槊舾?。而菌株B1581和菌株O對5種抗生素的MIC基本沒有改變。
　　 結論:
　　 1、

10、90株大腸埃希菌臨床株對6種抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，對氟喹諾酮類抗生素耐藥率較高，而對阿米卡星耐藥率較低;耐藥模式以雙藥耐藥和多重耐藥為主。
　　 2、外排泵基因acra/acrb基因在4種耐藥模式的大腸埃希菌臨床株中普遍存在，其中，在多重耐藥組中陽性率最高分別為84.6％和80.8％，在全敏感組陽性率最低分別為41.7％和33.3％。二者差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3、多數(shù)細菌具有主動外排作用，C