2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  肝癌是我國三大惡性腫瘤之一,雖然其發(fā)病機(jī)制尚不明確,但Ras信號通路的激活或Ras基因的突變在肝癌中普遍存在。另外,cyclin D1的過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期縮短、細(xì)胞過度增殖,是人類肝癌等多種原發(fā)性腫瘤的重要特征,也是腫瘤診斷和預(yù)后判斷的重要分子標(biāo)志物。Cyclin D1的表達(dá)主要受三個信號通路的調(diào)控:(1) ERK通過激活cyclin D1啟動子的順勢作用元件AP-1或Ets促進(jìn)其mRNA的表達(dá);(2)轉(zhuǎn)錄因子NF-κ

2、B通過結(jié)合cyclin D1啟動子上的GGG(G/A)NNYYCC序列促進(jìn)cyclin D1的mRNA表達(dá);(3) mTOR通過穩(wěn)定cyclin D1的mRNA和蛋白提升其蛋白表達(dá)水平。但不同組織的腫瘤以及同一組織腫瘤的不同亞型及不同發(fā)展階段的腫瘤細(xì)胞,調(diào)控cyclin D1表達(dá)的分子機(jī)制不同。特別是ERK、NF-κB和mTOR的協(xié)同作用模式尚有待深入闡明。本研究用H-ras12V肝癌轉(zhuǎn)基因小鼠和人Hep3B肝癌細(xì)胞株探究ERK、NF-

3、κB和mTOR在調(diào)控cyclin D1表達(dá)中的主導(dǎo)作用及相互協(xié)同關(guān)系,為cyclin D1表達(dá)調(diào)控模式的深入研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
  方法:
  1.體內(nèi)實驗
  對病理證實的H-ras12V轉(zhuǎn)基因雄鼠肝腫瘤組織、腫瘤周圍組織以及非轉(zhuǎn)基因雄鼠肝組織進(jìn)行總RNA及蛋白質(zhì)的提取。應(yīng)用RT-qPCR和Westem blot方法檢測cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。用Western blot方法檢測細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1

4、/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、NF-κB抑制蛋白α亞基(IκBα)的蛋白水平。
  2.體外實驗
  提取人正常肝細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞Hep3B的總RNA和蛋白質(zhì),RT-qPCR和Western blot法檢測cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。Western blot方法檢測ERK1/2、p-ERK1/2 p-mTOR、IκBα的蛋白水平。用ER

5、K、mTOR、NF-κB抑制劑處理Hep3B細(xì)胞,檢測cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
  結(jié)果:
  1.體內(nèi)實驗
  (1)病理檢測結(jié)果表明:Ras癌基因誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因小鼠的多發(fā)性肝腫瘤,腫瘤體積大,典型的直徑在5mm以上;病理切片顯示肝腫瘤細(xì)胞呈小梁狀生長排列,肝細(xì)胞癌變化明顯,肝區(qū)的病灶有不典型肝細(xì)胞聚集,胞漿嗜堿性,胞核濃染,含有高度未分化細(xì)胞并伴有壞死,腫瘤周圍損傷的肝細(xì)胞成扁平狀。腫瘤周圍組織與

6、正常小鼠的肝組織沒有明顯的病理學(xué)變化。沒有肝纖維化和肝硬化的病理特征。肝腫瘤組織與腫瘤周圍組織分界清晰。
  (2) cyclin D1表達(dá)水平的檢測結(jié)果表明:RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示,與非轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織、H-ras12V轉(zhuǎn)基因小鼠的肝腫瘤周圍組織相比,轉(zhuǎn)基因小鼠肝腫瘤組織中cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05);非轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織與腫瘤周圍組織中cyclin D1的mRNA和

7、蛋白表達(dá)水平無顯著變化。
  (3)信號通路檢測結(jié)果表明:與非轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織、H-ras12V轉(zhuǎn)基因小鼠肝腫瘤周圍組織相比,肝腫瘤組織中ERK和p-ERK的蛋白水平都顯著升高(P<0.05)。與非轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織相比,H-ras12V轉(zhuǎn)基因小鼠肝腫瘤周圍組織中ERK的蛋白水平?jīng)]有顯著變化,p-ERK的蛋白水平顯著升高(P<0.05)。與非轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織、H-ras12V轉(zhuǎn)基因小鼠肝腫瘤周圍組織相比,肝腫瘤組織中p-mTOR的水

8、平顯著升高(P<0.05),IκBα的蛋白水平顯著降低(P<0.05)。腫瘤周圍組織與非轉(zhuǎn)基因小鼠組織相比,p-mTOR和IκBα的蛋白水平?jīng)]有顯著變化。
  2.體外實驗
  (1) cyclin D1表達(dá)水平的檢測結(jié)果表明:人肝癌Hep3B細(xì)胞cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別是人正常LO2肝細(xì)胞的115.73和22.60倍(P<0.001)。
  (2)信號通路檢測結(jié)果表明:與LO2相比,Hep3B細(xì)

9、胞p-ERK1、ERK1、p-mTOR的蛋白水平分別升高10.87、24.77和20.60倍(P<0.05),IκBα的蛋白水平?jīng)]有顯著差異。
  (3)抑制劑處理實驗結(jié)果表明:與Hep3B細(xì)胞相比,ERK抑制劑PD184352處理Hep3B細(xì)胞對p-mTOR蛋白水平?jīng)]有明顯影響,但cyclin D1的mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.001),其蛋白表達(dá)水平也隨之在6-24h明顯降低;mTOR抑制劑Rapamycin處理Hep3

10、B細(xì)胞顯著提升了p-ERK的蛋白水平和cyclin D1的mRNA表達(dá)水平(P<0.001),但cyclin D1的蛋白表達(dá)水平在6-24h明顯降低;同時用ERK和mTOR的抑制劑處理Hep3B細(xì)胞,與ERK抑制劑的處理結(jié)果相同;NF-κB抑制劑BAY11-7082處理Hep3B細(xì)胞對cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響。
  結(jié)論:
  1.體內(nèi)研究表明,在Ras癌基因誘導(dǎo)的肝腫瘤發(fā)生過程中,MAPK/E

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