SSH技術(shù)篩選家蠅抗感染差異基因及抗菌肽時(shí)相表達(dá)模式的研究.pdf

1、蠅類屬節(jié)肢動(dòng)物門，昆蟲綱，雙翅目，環(huán)裂亞目，其免疫防御系統(tǒng)不同于脊椎動(dòng)物，一般認(rèn)為不存在適應(yīng)免疫。近年來，人們也開始在蠅類中探索免疫系統(tǒng)的起源和進(jìn)化，為研究昆蟲天然免疫和人類的天然免疫的相關(guān)性提供依據(jù)。蠅類在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了自身獨(dú)特的免疫機(jī)制，即缺乏哺乳動(dòng)物所具有的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，體內(nèi)沒有T細(xì)胞和B細(xì)胞，也沒有抗體、補(bǔ)體系統(tǒng)。那么，它們?cè)谑艿酵饨绮≡锴忠u時(shí)，其分子免疫機(jī)制及效應(yīng)免疫分子的表達(dá)情況是怎么樣的呢？本文擬采用SSH、

2、Real-time PCR等技術(shù)，以家蠅（Musca domestic）為材料，就此問題進(jìn)行初步探討。 1.家蠅最佳感染條件的確定。用三種常見的生物致病菌即金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli），球孢白僵菌（Beauveria bassiana Vuill），感染家蠅，觀察其感染后的性狀變化及存活率。發(fā)現(xiàn)它們引起家蠅有效感染的LC50分別為金葡菌（cells/

3、ml）LC50約為1010 cells/ ml，大腸桿菌為大于109 cells/ml，球孢白僵菌為OD600值1.98的菌濃度。 2.抑制性消減雜交(SSH)結(jié)果及分析。成功構(gòu)建了家蠅抗感染差異表達(dá)cDNA文庫(kù)。文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行PCR鑒定，挑取252個(gè)白色陽性克隆，表明插入片段主要分布在250~750bp之間。應(yīng)用反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)從消減cDNA文庫(kù)中高通量篩選了35個(gè)差異表達(dá)的克隆，其中32個(gè)為真陽性。得到252

4、個(gè)測(cè)序后，根據(jù)在GenBank非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(nr)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)中BLASTn序列比對(duì)結(jié)果，代表已知基因的ESTs按照基因功能分為八類：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞間通信、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞與機(jī)體防御、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯與表達(dá)調(diào)控、代謝及其它。結(jié)果顯示：家蠅具有與哺乳動(dòng)物相似的急性期免疫反應(yīng)基因表達(dá)（如 proteases inhibitor, respiratory burst, lysozymes and antimicrobial

5、peptides, etc等）其表達(dá)模式也是相同的，但是存在于脊椎動(dòng)物中的一些典型的急性期反應(yīng)蛋白，如C-reactive protein、serum amyloid P和serum amyloid A卻未能在家蠅中發(fā)現(xiàn)，這又體現(xiàn)了這兩類物種面對(duì)不同環(huán)境和微生物的選擇壓力可能采取不同的策略。家蠅具有與哺乳動(dòng)物相似的急性期免疫反應(yīng)基因，這為利用家蠅來研究免疫系統(tǒng)的進(jìn)化提供了進(jìn)一步的有力證據(jù)。但是，與脊椎動(dòng)物相比，家蠅也有著一些其他的參與急

6、性期免疫反應(yīng)的基因，進(jìn)一步研究這些發(fā)現(xiàn)的新基因?qū)⒂兄谌藗兩钊肓私饷庖呦到y(tǒng)起源和進(jìn)化的分子基礎(chǔ)。 3.代表免疫效應(yīng)分子抗菌肽的時(shí)相表達(dá)模式研究?？咕淖鰹橄夘愺w液免疫效應(yīng)分子的重要組成部分，我們對(duì)不同生長(zhǎng)階段卵、一齡、二齡、三齡、蛹、成蟲，誘導(dǎo)后不同時(shí)期家蠅三齡幼蟲抗菌肽基因進(jìn)行表達(dá)模式分析。結(jié)果顯示三種抗菌肽在家蠅體內(nèi)為組成性表達(dá)。在誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)，不同發(fā)育階段抗菌肽均普遍表達(dá)，但表達(dá)水平存在著明顯的差異，誘導(dǎo)后表達(dá)明顯升高