力達(dá)霉素及其聯(lián)合bortezomib抗骨髓瘤的分子機(jī)制研究.pdf

1、力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM)是本研究所從一株放線菌(Streptomyces globisporusC—1027)代謝產(chǎn)物中獲得的對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈殺傷作用的大分子肽類抗腫瘤抗生素，大量研究表明，LDM對(duì)多種腫瘤細(xì)胞及移植瘤具有極強(qiáng)的抗腫瘤活性，這都源于LDM對(duì)DNA的強(qiáng)烈地切割作用。最近研究顯示LDM可引起腫瘤細(xì)胞染色體畸變及端粒功能異常。目前，LDM正作為一種新的化療藥物進(jìn)行臨床Ⅱ期試驗(yàn)研究。本課題選用一種小鼠骨髓瘤細(xì)胞

2、株：SP2/0和2種人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株：U266和SKO-007，探討LDM體內(nèi)體外對(duì)鼠骨髓瘤和人多發(fā)性骨髓瘤的影響及其作用機(jī)制。此外本課題還初步研究了LDM聯(lián)合bortezomib對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266和SKO-007的影響，從而為L(zhǎng)DM聯(lián)合bortezomib的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。 1.LDM抗鼠骨髓瘤作用的分子機(jī)制研究。 1.1 LDM作用于小鼠骨髓瘤細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究。 1.1.1 MTS結(jié)果顯示L

3、DM顯著抑制鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞的增殖。 1.1.2 LDM對(duì)鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞形態(tài)的影響。 1.1.3 Hoechst33342熒光染色法和FITC—Annexin Ⅴ/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。 1.1.4 PI單染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞周期分布的影響。 1.1.5 Western blot法檢測(cè)了LDM對(duì)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的影響。

4、 1.1.6 Western blot法檢測(cè)了LDM對(duì)對(duì)絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen—activated protein kinases，MAPKs)信號(hào)通路分子的表達(dá)影響。 1.1.7 分別應(yīng)用JNK抑制劑(SP600125)、p38抑制劑(SB203580)和MEK抑制劑(U0126)預(yù)處理SP2/0細(xì)胞2h，再加入LDM(0.001nM，0.01nM，0.1nM，和1nM)繼續(xù)作用48h，MTS結(jié)果顯示單獨(dú)的3種

5、抑制劑對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用均不明顯，但SP600125或SB203580分別與LDM合用后均降低了LDM對(duì)SP2/0的細(xì)胞毒作用，提示JNK和p38MAPK的激活參與了LDM對(duì)SP2/0細(xì)胞的增殖抑制作用，而U0126與LDM合用后提高了LDM對(duì)SP2/0的細(xì)胞毒作用，提示ERK的激活有利于SP2/0細(xì)胞的生存。 1.1.8 SP600125預(yù)處理SP2/0細(xì)胞2h，再加入LDM(0.5nM)繼續(xù)作用48h，Westernblo

6、t結(jié)果顯示SP600125可消除LDM引起的JNK的活化，同時(shí)也消除了LDM引起的caspase—3和caspase—7的激活及PARP的切割。 1.2 LDM作用于小鼠骨髓瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。 2.LDM抗人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制研究。 2.1 LDM作用于人多發(fā)性骨髓瘤的體外實(shí)驗(yàn)研究。 2.1.1 MTS結(jié)果顯示LDM顯著抑制人MM細(xì)胞(U266和SKO-007)的增殖。 2.1.2

7、 LDM對(duì)人MM細(xì)胞形態(tài)的影響。 2.1.3 Hoechst33342熒光染色法和FITC—AnnexinⅤ/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)LDM對(duì)U266和SKO-007細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。 2.1.4 PI單染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)LDM對(duì)U266和SKO-007細(xì)胞周期分布的影響。 2.1.5 利用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察LDM對(duì)U266和SKO-007細(xì)胞遷移能力的影響。 2.1.6 Westernbl

8、ot法測(cè)定了LDM對(duì)侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)靶點(diǎn)分子的影響。 2.1.7 應(yīng)用Westernblot法測(cè)定了LDM對(duì)凋亡相關(guān)蛋白及細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)的影響。 2.1.8 應(yīng)用Westernblot法測(cè)定了LDM對(duì)MAPKs信號(hào)通路分子的表達(dá)影響。 2.1.9 為研究JNK、ERK和p38MAPK的激活在LDM增殖抑制中的作用，分別應(yīng)用SP600125、SB203580和U0126預(yù)處理U266細(xì)胞2h，再加入LDM(0.0

9、01nM，0.01nM，0.1nM，和1nMLDM)繼續(xù)作用48h，MTS結(jié)果顯示3種抑制劑單獨(dú)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用均不明顯，但SP600125或SB203580分別與LDM合用后均降低了LDM對(duì)U266的細(xì)胞毒作用，而U0126與LDM合用后提高了LDM對(duì)U266的細(xì)胞毒作用。在SKO-007細(xì)胞觀察到同樣的結(jié)果。 2.1.10 為了探討MAPKs的激活在LDM誘導(dǎo)凋亡中的作用，分別用SP600125、SB203580和U01

10、26預(yù)處理U266細(xì)胞2h，再加入LDM(0.5nM或1nMLDM)繼續(xù)作用48h，F(xiàn)ITC—AnnexinⅤ/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示單獨(dú)的3種抑制劑對(duì)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用均不明顯，但SP600125或SB203580分別與LDM合用后均降低了LDM對(duì)U266的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，而U0126與LDM合用后則提高了LDM對(duì)U266的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。在SKO-007細(xì)胞觀察到同樣的結(jié)果。 2.1.11 為了探討JNK、p

11、38MAPK的激活在LDM誘導(dǎo)凋亡中的作用機(jī)制，分別用SP600125和SB203580預(yù)處理U266細(xì)胞2h，再加入LDM(0.5nM)繼續(xù)作用48h，Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示單獨(dú)的兩種抑制劑對(duì)細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)影響不大，但SP600125或SB203580分別與LDM合用后均降低了LDM對(duì)PARP和aspase3/7的激活。在SKO-007細(xì)胞觀察到同樣的結(jié)果。 2.1.12 應(yīng)用Westernblot法測(cè)定

12、了LDM對(duì)NF—κB及IκBα表達(dá)的影響。結(jié)果顯示LDM劑量依賴性地誘導(dǎo)兩種人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞IκBα的磷酸化，但對(duì)總IκBα的表達(dá)無影響，在LDM的作用下，U266的NF—κB的表達(dá)濃度依賴性的降低，而SKO-007濃度依賴性的升高。 2.2 LDM對(duì)蛋白酶體活性的影響。 檢測(cè)了不同劑量的LDM作用于高純化的20S蛋白酶體對(duì)其胰凝乳蛋白酶樣活性的影響，發(fā)現(xiàn)所用的劑量(0.1nM、0.5nM、1nM和2nM)LDM對(duì)胰凝

13、乳蛋白酶樣活性沒有明顯的影響，不同劑量的LDM作用于MM細(xì)胞48h，提取26S蛋白酶體，定量后檢測(cè)胰凝乳蛋白酶樣活性結(jié)果同上?？梢奓DM發(fā)揮強(qiáng)大的凋亡誘導(dǎo)作用，并不是通過對(duì)蛋白酶體活性抑制實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大劑量的LDM(100nM、1000nM和10，000nM)具有激活胰凝乳蛋白酶樣活性的作用。 3.LDM聯(lián)合bortezomib作用于人多發(fā)性骨髓瘤的的體外實(shí)驗(yàn)研究。 3.1 LDM聯(lián)合bortezomib抗多發(fā)性骨髓

14、瘤的協(xié)同作用。 3.1.1 MTS結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合作用時(shí)，能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，其CDI<1，具有協(xié)同抗腫瘤作用。 3.1.2 FITC—AnnexinⅤ/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示聯(lián)合用藥可明顯增強(qiáng)單藥的凋亡誘導(dǎo)率。低聯(lián)合濃度(0.5nM的LDM與5nM的bortezomib)對(duì)U266細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率為22.91％，明顯高于兩藥單用誘導(dǎo)的凋亡率15.07％及3.90％，較高聯(lián)合濃度(0.5nM的LDM與10

15、nM的bortezomib)對(duì)U266細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率為67.11％，明顯高于兩藥單用誘導(dǎo)的凋亡率15.07％及5.91％，在SKO-007細(xì)胞觀察到同樣的結(jié)果。 3.2 LDM聯(lián)合bortezomib協(xié)同抗多發(fā)性骨髓瘤的作用機(jī)制。 3.2.1 Westernblot結(jié)果顯示LDM聯(lián)合bortezomib后可使PARP和caspase—3的切割顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步上調(diào)了p21的表達(dá)。聯(lián)合用藥還降低NF—κB的水平。

16、3.2.2 Westernblot法測(cè)定了單藥及聯(lián)合用藥對(duì)MAPKs的表達(dá)影響，結(jié)果顯示，bortezomib呈劑量依賴性地激活JNK和p38MAPK。兩藥聯(lián)合后可使JNK和p38MAPK的激活顯著增強(qiáng)。相反，兩藥聯(lián)合后可使ERK的激活顯著降低。 綜上，研究表明LDM能夠顯著抑制體外培養(yǎng)的鼠骨髓瘤和人多發(fā)性骨髓瘤的細(xì)胞的增殖，比其他常規(guī)化療藥細(xì)胞毒作用更大。并通過激活JNK和p38MAPK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低腫瘤細(xì)胞VEGF和MM