新型炎癥相關基因CNT2b的發(fā)現、克隆及功能初探.pdf

1、炎癥和免疫反應是一種常見的病理過程，大多數的人類疾病均與此有關。除了人們所熟知的感染性疾病外，風濕性關節(jié)炎、類風濕疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝纖維化、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、阿爾茨海默病以及惡性腫瘤等多種疾病也與炎癥密切相關。炎癥免疫因素參與了這些疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉歸整個過程。巨噬細胞是機體免疫系統(tǒng)的一種重要細胞，不僅具有很強的吞噬功能，而且是主要的抗原提呈細胞，在多種炎癥和免疫反應中起關鍵作用。活化的巨噬細胞可分泌多種生物活性物質，如一

2、氧化氮、白介素.1、腫瘤壞死因子α、活性氧以及前列腺素、白三烯等花生四烯酸代謝產物。誘生型環(huán)氧酶(cyclooxygenase，COX)-COX-2可大量表達于巨噬細胞中。種種研究跡象表明，COX-2并非專一性地參加炎癥反應，還在保護胃粘膜、維護腎臟功能、學習記憶等方面發(fā)揮重要作用，可能還存在其它亞型。眾多的炎癥因子在炎癥反應的不同時期組成復雜的網絡，相互作用，共同調控炎癥反應的的進程和預后。巨噬細胞在炎癥免疫反應中所起的重要作用，且其

3、在誘導狀態(tài)下能大量表達COXs，因此我們擬針對COX的保守序列設計簡并引物，選擇急性炎癥誘導下的巨噬細胞cDNA作為模板克隆新型COX亞型或炎癥相關性基因，并對其表達特征和功能進行初步研究。 方法: 1.分析不同物種、不同亞型的COX的保守序列，設計簡并引物。 2.采用腹腔注射酵母多糖A的方法建立SD大鼠急性腹膜炎模型，采集腹腔巨噬細胞，提取總RNA，進行RT-PCR，擴增產物純化后連接T載體，轉化DH5a細菌，

4、抽提質粒，測序。 3.選取新型序列，進行3’，5’快速末端反應，獲取全長基因序列。 4.采用Realtime RT-PCR法分別檢測新基因CNT2 mRNA、CNT2b mRNA在大鼠不同臟器組織中的表達情況，以及在酵母多糖誘導的急性腹膜炎大鼠腹腔巨噬細胞中表達的時相特征。 5.應用Realtime RT-PCR法觀察抗炎藥物阿司匹林(12mg/kg)、塞來昔布(0.13mg/kg)和潑尼松(0.4mg/kg)對

5、大鼠腹腔巨噬細胞中CNT2b mRNA和CNT2 mRNA表達的影響。 6.針對CNT2b序列設計siRNA干擾序列，采用脂質體轉染體外培養(yǎng)NR8383大鼠巨噬細胞；Realtime RT-PCR法檢測干擾后細胞中炎癥相關因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、IL-10以及CNT2、CNT2b等分子的mRNA表達情況。 結果: 1.不同物種的COX-1、COX-2和COX-3序列中存在兩段

6、氨基酸保守序列。 2.從大鼠腹腔巨噬細胞中發(fā)現并克隆了一個新基因，全長13330nt，為—mRNA序列，對應DNA位于大鼠第三號染色體3q35區(qū)。經BLAST分析與序列比對，該基因與Na+依賴性核苷轉運載體(Na+/nucleoside cotransporter，CNT)2有較高同源性，保留了CNT2的第1、7～14、16、17內含子；并且，在CNT2的最后一個(第18個)外顯子后，又附加了一段3169nt長的序列。由于該基因

7、和CNT2均包含加尾信號和polyA尾巴，均為完整的轉錄產物，故確定為CNT2的剪接異構體，已提交Genbank數據庫并獲得登錄號：EU032627.2，重新命名為CNT2b。 3.CNT2 mRNA在全身各器官均有表達，其中在心臟、肝臟、平滑肌、脾臟表達較高；CNT2b mRNA在正常器官中表達量遠遠少于CNT2 mRNA，其中心臟、平滑肌、肝臟表達稍高。 4.CNT2b mRNA在腹膜炎大鼠腹腔巨噬細胞中的表達具有顯

8、著時相特征。注射酵母多糖后，其表達顯著升高，至2h時達到最高點；隨后，表達量逐漸降低，至24h時基本恢復至0.5h時的水平；致炎后36h，表達量再次明顯升高，至第48h時又降至36h時的47.52％。CNT2 mRNA在腹膜炎大鼠腹腔巨噬細胞中的表達也具有類似特征，其時相變化幅度遠少于CNT2b mRNA。 5.三種抗炎藥物阿司匹林、潑尼松、塞來昔布均能明顯降低CNT2b mRNA表達量。在臨床使用劑量下，潑尼松作用最強，阿司匹

9、林次之，塞來昔布最弱。 6.抑制CNT2b基因表達后NR8383細胞中IL-1βmRNA，IL-6 mRNA，TNF-αmRNA，COX-2 mRNA的表達均顯著升高，IL-10 mRNA的表達明顯降低。 結論: 1.在大鼠腹腔巨噬細胞中發(fā)現并克隆了一個新基因CNT2b。 2.CNT2b屬于炎癥誘導性高表達基因，在正常組織中很少表達，而在急性炎癥刺激的巨噬細胞中表達顯著增加。在大鼠急性腹膜炎過程中，腹腔巨