華支睪吸蟲組織蛋白酶L基因克隆表達和生物學(xué)特性研究.pdf

1、本課題組從華支睪吸蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫的EST序列中，識別出了編碼cathepsin L樣蛋白的全長cDNA序列。本論文以該基因及其編碼蛋白為研究對象，主要研究其生物學(xué)特性，依此評價它在免疫診斷和疫苗研究方面的應(yīng)用前景，給肝吸蟲病的診斷和防治提供更多的新思路和方法。 目的和意義： 基于蠕蟲在寄生蟲營養(yǎng)代謝、免疫逃避、毒力、組織細胞入侵、脫包囊/包囊形成中發(fā)揮的關(guān)鍵性作用，是免疫診斷、疫苗研制和藥物篩選的理想分子；而目前

2、對cathepsin L在肝吸蟲與宿主相互關(guān)系中的作用缺乏全面認識，因此從本課題組已構(gòu)建的華支睪吸蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫中，尋找華支睪吸蟲的cathepsin L，識別出該酶基因的全長cDNA編碼序列。對原核表達的重組CsCatL蛋白進行基本生物學(xué)特性研究，依此評價它在免疫診斷和疫苗研究方面的應(yīng)用前景，給肝吸蟲病的診斷和防治提供更多的新思路和方法。 方法： 1.CsCatL基因的生物信息學(xué)分析 通過BLASTx方

3、法搜索GenBank中其他物種的同源序列，并進行多序列同源性比對，分析該蛋白的分子進化規(guī)律；并利用生物信息學(xué)技術(shù)對CsCatL的拓撲結(jié)構(gòu)、抗原表位、功能域、以及蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)等基本結(jié)構(gòu)和功能特征進行全面的分析和預(yù)測，用于指導(dǎo)實驗研究。 2.CsCatL基因的克隆表達和重組蛋白的純化和復(fù)性 針對所預(yù)測的蛋白結(jié)構(gòu)特征，應(yīng)用分子克隆技術(shù)分別構(gòu)建CsCatL的前體蛋白、前體肽和成熟肽三個片段的pET—28a原核表達質(zhì)粒，在大腸桿

4、菌中以包涵體形式表達。用6M尿素溶解包涵體，在變性條件下使用6his—binding親和層析純化重組蛋白，獲得的變性純化蛋白采用透析方法通過逐步降低尿素濃度進行復(fù)性，在尿素濃度為1M時改用PBS透析，以去除尿素。 3.CsCatL重組蛋白的酶學(xué)特性和功能研究 以特異熒光合成肽Z—Phe—Arg—MCA和Z—Arg—Arg—MCA為底物，測定rCsCatL—mature的肽水解活性。通過熒光酶標儀測定，激發(fā)光360nm，測

5、定465nm熒光波長的吸光度，依據(jù)AMC標準品制定的標準曲線，換算為產(chǎn)物濃度。計算酶動力學(xué)參數(shù)。并通過酶抑制劑進一步研究其酶學(xué)特性。通過對牛血清白蛋白、人IgG和血紅蛋白水解作用來分析其生物學(xué)功能。 4.CsCatL為華支睪吸蟲成蟲分泌/排泄物的鑒定及在成蟲、囊蚴和尾蚴的組織定位 將純化的rCsCatL—promature免疫大鼠制備特異性抗體，對成蟲分泌/排泄物進行Western blot分析。 RT—PCR

6、檢測CsCatL基因在囊蚴和尾蚴表達情況。 熒光免疫組化方法觀察CsCatL在肝吸蟲成蟲、囊蚴和尾蚴階段的組織定位，成蟲和囊蚴制作成石蠟切片，尾蚴采用活體。一抗為anti—rCsCatL—promature的rat血清，陰性血清采用rat免疫前陰性血清。熒光顯微鏡下觀察拍照。 5.CsCatL用于免疫學(xué)診斷效果的評價 分別以rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—prop

7、etid作為抗原，通過ELISA方法檢測華支睪吸蟲病人血清中特異IgG、IgG1、IgG2a、IgG4、IgE和IgA，并與日本血吸蟲、肺吸蟲、蛔蟲、鞭蟲和鉤蟲感染的人血清進行交叉反應(yīng)測試，分析和評價三個重組蛋白的檢測效果。 6.CsCatL免疫保護作用 rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptide免疫大鼠，在免疫組大鼠血清中特異性IgG抗體效價高于1:102，

8、400時，進行肝吸蟲囊蚴感染。感染后第20天，每天收集糞便查蟲卵，確定最早排蟲卵時間；查到蟲卵后，間隔1周，連續(xù)3次，收集糞便，按照司徒爾氏法進行蟲卵計數(shù)；感染后第70天殺鼠，收集成蟲計數(shù)。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1.CsCatL基因的生物信息學(xué)分析 CsCatL基因全長1458bp，編碼區(qū)為80-1191，編碼371aa，在5’端和3’端都有非翻譯區(qū)，是全長編碼序列，Ge

9、nBank中的登錄號為DQ902583。編碼371aa，aa1-18為分泌型信號肽，aa109-127為前體肽，aa128-371為成熟肽，屬胞外分泌型蛋白。在前體肽具有cathepsin L的保守結(jié)構(gòu)域ERFNIN、GNFD；成熟肽具有構(gòu)成木瓜蛋白酶活性中心的3個保守催化位點Asn338、Cys177、His318；N端aa67-127位是保守木瓜蛋白酶前體肽抑制功能域；C端aa57-370屬于木瓜蛋白酶家族；C端aa153-370

10、Peptidase C1功能域?qū)倌竟系鞍酌讣易逯械腖類；與日本血吸蟲Cathepsin L1的氨基酸序列的一致可能性達53％，相似可能性達69％；預(yù)測屬Cathepsin L樣蛋白。前體蛋白的理論分子量是40.87kDa，pI是5.14。B細胞線性表位主要位于前體肽段內(nèi)，并且序列的保守性明顯低于酶活性區(qū)域，提示該功能域具有比成熟肽抗原更好的敏感性和特異性。在物種進化關(guān)系上，與日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、肝片吸蟲和衛(wèi)氏并殖吸蟲源于同一祖先，與

11、日本血吸蟲親緣關(guān)系最近。 2.CsCatL基因的克隆表達和重組蛋白的純化和復(fù)性 成功構(gòu)建原核pET—28a(+)重組表達質(zhì)粒，重組質(zhì)粒在原核E.coli BL21以包涵體形式表達，經(jīng)變性純化和復(fù)性后獲得到較純可溶性重組蛋白，rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptid濃度分別為780μg/ml、890μg/ml.200μg/ml。 3.CsCatL重組蛋白的

12、酶學(xué)特性和功能研究 rCsCatL—mature在二硫蘇糖醇存在時有水解活性，優(yōu)先水解Z—Phe—Arg—AMC而不是Z—Arg—Arg—AMC，其活性100％被特異性半胱氨酸蛋白酶抑制因子E—64和硫醇封閉試劑IAA抑制，胰蛋白酶類抑制劑TPCK和絲氨酸蛋白酶類抑制劑PMSF分別抑制77％和13％酶活性，金屬離子螫合劑EDTA沒有抑制作用，顯示CsCatL屬于典型Cathepsin L類的半胱氨酸蛋白酶。 rCsC

13、atL—mature在pH4.5-6.0酶活性較高，在pH5.5酶活性最高；28-42℃酶活性差別不是太大，42℃酶活性最高的；假設(shè)所有rCsCatL—maturer都具有酶活性，Km值是5.71×10-6 M，Vmax=0.6μM/min；一個酶活單位是2.95μg。 rCsCatL—mature在體外能降解BSA，不水解人IgG和血紅蛋白。 Meb、Alb和Tem對rCsCatL—mature酶活性沒有任何抑制作

14、用，F(xiàn)enb和Pra有15％左右輕度抑制作用。 4.CsCatL為華支睪吸蟲成蟲分泌/排泄物的鑒定及在成蟲、囊蚴和尾蚴的組織定位 Western blot結(jié)果顯示感染肝吸蟲的陽性血清能識別rCsCatL—promature，而anti—rCsCatL—promature血清僅識別出ESPs一條帶，該條帶位置雖然不在CsCatL分子量附近，但接近理論成熟肽分子量，說明CsCatL是成蟲的分泌/排泌物。 RT—P

15、CR結(jié)果顯示CsCatL基因在囊蚴和尾蚴階段均有表達。 熒光免疫組化結(jié)果顯示CsCatL在成蟲定位于腸支，在囊蚴和尾蚴定位于合胞體即皮層細胞和皮層。 5.CsCatL用于免疫學(xué)診斷效果的評價 rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptide檢測肝吸蟲病人血清特異IgG，交叉反應(yīng)均很嚴重。rCsCatL—promature檢測肝吸蟲病人血清中特異IgG1敏感性

16、高(24/24例)，但與血吸蟲、肺吸蟲、蛔、鞭、鉤感染者均有交叉反應(yīng)；rCsCatL—propeptid則檢測血清中特異IgG4敏感性高(24/24例)，與血吸蟲和肺吸蟲感染者有交叉反應(yīng)(主要是肺吸蟲)。rCsCatL—propeptid檢測101例不同感染度肝吸蟲病人血清中特異IgG4的陽性檢出率為90.1％，隨感染度增加，陽性檢出率上升，呈現(xiàn)出一定相關(guān)性；檢測重度以上感染者陽性檢出率高于輕度感染者(P<0.05)。 6.Cs

17、CatL免疫保護作用 rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptide免疫大鼠后，血清中特異性IgG水平顯著升高，至初次免疫后6w達高峰，以IgG1和IgG2為主；在血清特異性IgG效價高于1:102，400，進行肝吸蟲囊蚴攻擊感染，感染后第70天殺鼠。免疫組與對照組的EPG和成蟲數(shù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理無顯著性差異，說明終宿主經(jīng)CsCatL免疫后對囊蚴感染無免疫保護作用。