日本血吸蟲SCP-TAPS蛋白的克隆表達和生物學功能初步研究.pdf

1、血吸蟲病是一種分布廣泛，危害嚴重的人獸共患病。目前，WHO估計全世界有約74個國家和地區(qū)流行該病，約2億人受感染，每年死于血吸蟲病的人數(shù)達百萬之多，血吸蟲病至今仍是亟待解決的嚴重的公共衛(wèi)生問題。目前，血吸蟲病的防治措施主要是在易感地區(qū)進行大規(guī)模的化療、滅螺和健康教育?；熾m然可暫時降低發(fā)病率，但不能抑制再感染的發(fā)生，也不能阻止感染的傳播，況且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些血吸蟲株對化療藥物如吡喹酮產(chǎn)生抗性。為彌補藥物治療的不足，WHO/TDR將血吸蟲病疫

2、苗的研究列為優(yōu)先發(fā)展的項目之一而予以重點支持。隨著日本血吸蟲基因組測序的完成，對其不同發(fā)育階段基因和蛋白表達動態(tài)變化的了解，將有助于探索血吸蟲生長發(fā)育機制，尋找與其生長發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵的酶、功能蛋白或基因，為研制有效的阻斷傳播疫苗和新藥開發(fā)提供科學指導。
　　 在我們通過日本血吸蟲EST數(shù)據(jù)庫尋找與生長發(fā)育有關(guān)的基因時，我們發(fā)現(xiàn)一感興趣的基因家族——SCP/Tpx-1/Ag5/Pr-1/Sc7(SCP/TAPS)蛋白家族。幾乎所有

3、真核生物都含有SCP/TAPS蛋白，這些蛋白的共同特點是都具有SCP保守結(jié)構(gòu)域。目前，SCP保守結(jié)構(gòu)域的確切功能還不是很清楚，但研究發(fā)現(xiàn)不同生物中SCP/TAPS蛋白發(fā)揮著不同的生物學作用，如調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、性發(fā)育成熟、潛在的疫苗候選分子等。目前，許多吸蟲、線蟲中都有SCP/TAPS蛋白的研究報道，但對日本血吸蟲SCP/TAPS蛋白還沒進行詳細的分析和研究，因此我們通過生物信息學工具對日本血吸蟲這一蛋白家族進行分析，并挑選出感興趣的蛋白作

4、為進一步研究的對象。
　　 目的：通過NCBI上公共數(shù)據(jù)庫檢索出日本血吸蟲SCP/TAPS蛋白，序列同源比對、分子進化樹分析等生物信息學工具對它們進行詳細的分析，找到它們之間的異同點。從中挑選出感興趣的基因進行深入的研究，初步探討它們在日本血吸蟲生活史的完成過程中所發(fā)揮的生物學作用。
　　 方法：
　　 ⑴以黃蜂毒液抗原5為檢索源，通過tBLASTx檢索日本血吸蟲基因組數(shù)據(jù)庫，檢索出同源的EST序列。利用生物信息

5、學軟件對各序列的結(jié)構(gòu)域、信號肽進行分析，多序列同源比對和分子進化樹分析其進化規(guī)律，從中挑選出SiSCP1、SjSCP2作為進一步研究的對象。
　　 ⑵根據(jù)SjSCP1、SjSCP2的cDNA序列PCR擴增出相應(yīng)的片段，并克隆到原核表達載體pET-28a(+)中，大腸桿菌中誘導表達，親和層析純化目的蛋白。
　　 ⑶RT-PCR檢測SjSCP1、SjSCP2在雌蟲、雄蟲、蟲卵和尾蚴各階段轉(zhuǎn)錄水平的不同。rSjSCP1、rSj

6、SCP2免疫小鼠得到特異性抗體，制備各階段蟲體粗抗原，Western-blotting分析SjSCP1、SjSCP2在各階段蛋白表達水平的不同。
　　 ⑷以rSjSCP1抗血清為一抗，對日本血吸蟲感染的兔肝臟石蠟切片以及尾蚴進行SjSCP1的組織學定位分析。
　　 ⑸尾蚴攻擊感染BALB/c小鼠，分別于感染前和感染后取血，每周1次，連續(xù)12周，ELISA檢測小鼠血清中抗原特異性總IgG、IgG1、IgG2a抗體的動態(tài)變化

7、。
　　 ⑹rSjSCP1、rSjSCP2特異性抗體對小鼠日本血吸蟲感染的影響rSjSCP1、rSjSCP2免疫BALB/c小鼠，每2周一次，共三次，末次免疫后2周經(jīng)皮膚感染日本血吸蟲尾蚴，同時設(shè)置PBS對照組。感染后42天處死小鼠，計數(shù)成蟲回收數(shù)、每克肝蟲卵數(shù)，計算減蟲率和減卵率。rSjSCP1另設(shè)一組攻擊感染后2周再行蛋白免疫，方法同前但只加強免疫一次。取小鼠肝臟石蠟包埋后做病理切片并HE染色，測量單個蟲卵肉芽腫直徑，觀察r

8、SjSCP1、rSjSCP2特異性抗體對蟲卵肉芽腫的影響。ELISA檢測每次免疫后及攻擊感染后2周、4周、6周血清中抗原特異性總IgG、IgG1、IgG2a抗體的動態(tài)變化。
　　 ⑺SPSS統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行分析處理，采用Student's t檢驗觀察各組數(shù)據(jù)間有無統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果：
　　 ①以黃蜂毒液抗原5為檢索源，通過tBLASTn檢索日本血吸蟲EST數(shù)據(jù)庫，共搜索出65條EST序列。經(jīng)過序列比對

9、，排除重復序列，共得到17條Unigene。NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫搜索發(fā)現(xiàn)它們均具有SCP保守結(jié)構(gòu)域，除AAW25499具有2個外其它均只有一個。序列同源比對和分子進化樹分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白可以分為3個不同的亞組。經(jīng)PCR確定后，AAW24529和AAW24579作為進一步的研究對象，并分別命名為SjSCP1、SjSCP2。SjSCP1完整ORF含666bp，編碼221個氨基酸，理論分子量為24.34 kDa，理論等電點為9.38，Sig

10、nalP預測前25個氨基酸為分泌信號肽序列。序列中含有6個N-糖基化位點，5個N-肉豆蔻酰位點，3個蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點和1個低密度脂蛋白受體。與曼氏血吸蟲SmVAL15氨基酸序列一致性最高，達58％。BepiPred預測SjSCP1中存在12個B細胞線性表位。SjSCP2完整ORF含582bp，編碼193個氨基酸，理論分子量為22.28kDa，理論等電點為9.11。序列中含有1個N-糖基化位點，3個N-肉豆蔻酰位點，4個蛋白

11、激酶C(PKC)磷酸化位點和1個的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點。與曼氏血吸蟲SmVAL12氨基酸序列的一致性最高，可達60％。BepiPred預測SjSCP2內(nèi)存在7個B細胞線性表位。
　　 ②根據(jù)GeneBank中SjSCP1、SjSCP2的ORF序列設(shè)計特異性的引物，進而將目的基因片段定向克隆到pET-28a(+)載體中，雙酶切和測序證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導后有表

12、達，表達產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化，獲得目的蛋白。
　　 ③RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)SjSCP1只在蟲卵、尾蚴階段有表達。Western blotting發(fā)現(xiàn)抗SjSCP1小鼠血清可以識別出可溶性蟲卵抗原、蟲卵分泌排泄抗原中的一蛋白條帶，說明SjSCP1主要由蟲卵分泌。但所識別的分子條帶大小約35kDa，明顯大于SjSCP1的理論預測分子量。免疫熒光發(fā)現(xiàn)SjSCP1主要由蟲卵內(nèi)的毛蚴和尾蚴的腺體分泌。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)SjSCP2在雌蟲、

13、雄蟲、蟲卵和尾蚴階段都有表達，抗SjSCP2小鼠血清可識別出可溶性成蟲抗原一蛋白條帶，分子量與SjSCP2的理論預測分子量大小一致。
　　 ④日本血吸蟲感染的BALB/c小鼠體內(nèi)SjSCP1、SjSCP2特異性抗體分析ELISA檢測發(fā)現(xiàn)SjSCP1特異性總IgG抗體在小鼠感染日本血吸蟲6周后開始升高，并一直維持在這一較高水平?？贵w亞類分析發(fā)現(xiàn)抗原特異性IgG1抗體水平明顯高于IgG2a抗體水平。而SjSCP2特異性總IgG抗體在

14、小鼠感染后一直維持在一較低的水平，直到感染后第9周才有所增加，其中以抗原特異性IgG1抗體升高為主，IgG2a抗體水平與感染前相比無明顯變化。
　　 ⑤rSjSCP1、rSjSCP2特異性抗體對小鼠日本血吸蟲感染的影響rSjSCP1免疫BALB/c小鼠后，血清中抗原特異性總IgG抗體水平明顯升高，抗體亞類分析發(fā)現(xiàn)抗原特異性IgG1、IgG2a抗體都升高；小鼠攻擊感染后2周再免疫rSjSCP1誘導出的免疫應(yīng)答也如此，在感染后第4周

15、抗體水平明顯升高。rSjSCP2免疫后抗原特異性總IgG抗體升高，抗體亞類分析發(fā)現(xiàn)以IgG1升高為主。攻擊感染后發(fā)現(xiàn)rSjSCP1、rSjSCP2特異性抗體對機體均無免疫保護作用，成蟲數(shù)和每克肝蟲卵數(shù)較PBS對照組有所增加。肝臟病理切片發(fā)現(xiàn)rSjSCP1免疫感染組單個蟲卵肉芽腫大小與對照組無明顯差異，但rSjSCP2免疫組單個蟲卵肉芽腫面積明顯減少，說明rSjSCP2特異性抗體可減輕小鼠肝臟免疫病理損傷，具有調(diào)節(jié)宿主與血吸蟲免疫應(yīng)答的潛

16、能。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴生物信息學分析發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲中存在17個SCP/TAPS蛋白，它們可以分為3個亞組。
　　 ⑵SjSCP1在蟲卵和尾蚴階段有表達，并為蟲卵分泌排泄抗原的成份之一，主要定位在蟲卵內(nèi)的毛蚴和尾蚴的腺體；SjSCP2在雌蟲、雄蟲、蟲卵和尾蚴階段都有表達。
　　 ⑶小鼠感染后6周，SjSCP1特異性抗體水平開始升高并一直維持在這一較高水平，其中以抗原特異性IgG1升高為主；而日本血吸蟲