體外培養(yǎng)骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的死亡機(jī)制及抗氧化損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)的研究一直是神經(jīng)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)之一，NSCs移植或促進(jìn)自體腦內(nèi)NSCs再生為治療多種損傷性或退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)疾病提供了一鐘新的策略，已經(jīng)成為CNS疾病治療中引人注目的研究方向。NSCs基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中，體外培養(yǎng)是最基礎(chǔ)和必不可少的階段，這一階段NSCs的生長情況以及生物學(xué)性狀的保持直接影響著體內(nèi)移植治療的效用。NSCs移植

2、已經(jīng)開始應(yīng)用于一部分病例的臨床試驗(yàn)，但如何避免體外傳代培養(yǎng)及移植后NSCs的衰退和死亡，維持其長期存活、發(fā)育、分化并行使功能依然是一系列復(fù)雜而重要的問題。 相對(duì)于胚胎或成體腦內(nèi)來源NSCs及永生化神經(jīng)元，骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞(bonemarrowstromalcells-derivedneuralstemcells，BMSCs-d-NSCs)因其取材容易、來源充足、致瘤風(fēng)險(xiǎn)低、避免倫理爭議、可自體移植，更貼近未來臨床應(yīng)用。但因其為

3、非神經(jīng)組織來源，除一般的取材、分離，更須經(jīng)體外誘導(dǎo)、分化及調(diào)控階段，復(fù)雜的體外條件下更容易發(fā)生細(xì)胞損傷導(dǎo)致衰退和死亡。故研究BMSCs-d-NSCs衰退和死亡的機(jī)制并尋求有效手段維持和促進(jìn)其長期存活具有重要臨床意義。 本研究以大鼠BMSCs-D-NsCs作為研究對(duì)象，一方面，通過分離、培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，促其向NSCs分化，觀察其體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性，了解其不同培養(yǎng)階段的衰退和死亡(壞死和凋亡)情況；另一方面，通過抗氧化劑E

4、UK-134的抗氧化損傷作用，研究其對(duì)大鼠BMSCs-D-NSCs存活的影響，探索細(xì)胞分離培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化過程中減少其氧化損傷、促進(jìn)存活的新策略。 第一部分：體外培養(yǎng)條件下骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞衰退和死亡情況的觀察 目的:動(dòng)態(tài)觀察體外培養(yǎng)不同時(shí)間段骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞(bonemarrowstromalcells-derivedneuralstemcells，BMSCs-d-NSCs)的衰退和死亡情況，了解其體外培養(yǎng)條件下衰退和

5、死亡的機(jī)制與規(guī)律。 方法:以密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，以神經(jīng)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基促其向NSCs分化，以AO染色、Rhodamine123染色、TUNEL法及.AnnexinV-EGFP/PI雙染熒光顯微鏡下直接觀察、并流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同培養(yǎng)階段細(xì)胞凋亡和壞死情況。 結(jié)果:多種檢測(cè)方法證實(shí)，BMSCs-d-NSCs在體外培養(yǎng)條件下7d、14d、21d、4w、8w均會(huì)出現(xiàn)不同程度以凋亡為主的衰退和死亡現(xiàn)象，培養(yǎng)4w以

6、上細(xì)胞凋亡和壞死情況較3w內(nèi)明顯增多。 結(jié)論:體外培養(yǎng)BMSCs-d-NSCs的衰退和死亡有凋亡和壞死兩種機(jī)制的共同參與，并隨時(shí)間延長凋亡和壞死事件逐漸增多，為下一步探索相應(yīng)的細(xì)胞保護(hù)研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分：EUK-134對(duì)骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞抗氧化損傷作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的:研究抗氧化劑EUK-134對(duì)體外培養(yǎng)條件下骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞(bonemarrowstromalcells-derivedneural

7、stemcells，BMSCs-d-NSCs)的抗氧化損傷作用。 方法:以密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，以神經(jīng)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基促其向NSCs分化，以0.5mM、1mM、2mM三種濃度EUK-134添加培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs-d-NSCs，分別在2w、4w時(shí)以AnnexinV-EGFP/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以同一取材的未添加EUK-134常規(guī)培養(yǎng)的同期細(xì)胞為對(duì)照，比較各組細(xì)胞凋亡和壞死情況。 結(jié)果:各組細(xì)胞傳代培

8、養(yǎng)后，各EUK-134處理組較對(duì)照組活力更為旺盛，增殖速度快，細(xì)胞凋亡和壞死情況減少。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果可見培養(yǎng)2w時(shí)各組間凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例均有明顯差異；1mM、2mMEUK-134處理組細(xì)胞凋亡和壞死比例均明顯少于對(duì)照組。培養(yǎng)4w時(shí)各組凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例也均有明顯差異；各EUK-134處理組細(xì)胞凋亡和壞死比例均明顯少于對(duì)照組，且1mM、2mM處理組細(xì)胞凋亡和壞死比例也少于0.5mM處理組。 結(jié)論:抗氧化劑EUK-

9、134可以減少體外培養(yǎng)BMSCs-d-NSCs的凋亡和壞死，特別是以1.0mM、2.0mMEUK-134培養(yǎng)細(xì)胞，更具明顯的抗氧化損傷作用，能夠增強(qiáng)細(xì)胞活力，減少細(xì)胞的凋亡和壞死事件的發(fā)生。 本課題致力于研究體外培養(yǎng)骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞衰退和死亡的機(jī)制并尋求維持和促進(jìn)其長期存活的有效手段。 本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)BMSCs-d-NSCs為研究對(duì)象，選用四種方法聯(lián)合檢測(cè)，分別從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、線粒體跨膜電位、生化改變、細(xì)胞膜水平、細(xì)胞

10、核DNA片斷化等不同角度，以及應(yīng)用相差顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀等多種手段動(dòng)態(tài)觀察、驗(yàn)證和區(qū)分BMSCs-d-NSCs體外培養(yǎng)過程中衰退死亡情況。 結(jié)果證實(shí)： (一)BMSCs-d-NSCs在體外培養(yǎng)不同階段的細(xì)胞死亡事件中，均有凋亡和壞死兩種機(jī)制的共同參與，并多以凋亡為主，隨時(shí)間延長細(xì)胞凋亡和壞死情況均逐漸增多，培養(yǎng)4w后較3w內(nèi)更為明顯。 (二)抗氧化劑EUK-134可以明顯減少體外培養(yǎng)BMSCs-d-N