褪黑素對大鼠脊髓源性神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)及誘導分化影響的實驗研究.pdf

1、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是臨床常見創(chuàng)傷，常導致四肢截癱等嚴重后果。近年來，脊髓損傷及修復的有關研究取得很大進展，神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）的發(fā)現(xiàn)及細胞移植被認為是治療脊髓損傷的希望，是最有前景的方法之一。本實驗目的旨在研究脊髓源性神經(jīng)干細胞培養(yǎng)，增殖及定向誘導NSCs 向神經(jīng)元分化，為治療脊髓損傷提供合適的種子細胞，為進一步細胞移植提供一定實驗基礎。 實驗一胚胎大鼠

2、脊髓源性神經(jīng)干細胞分離及體外培養(yǎng) 從孕14d 胚胎大鼠的脊髓中分離得到脊髓NSCs,采用無血清法培養(yǎng)并傳代純化.觀察細胞生長狀況及特性,進行神經(jīng)巢蛋白抗原（neuroepithelial stemcell protein，Nestin）鑒定。結(jié)果：分離所得NSCs 具有連續(xù)克隆能力，呈懸浮狀態(tài)生長。在無血清培養(yǎng)條件下，脊髓源性NSCs 快速增殖，48-72h內(nèi)可形成細胞球（neurosphere），將這些細胞球吹打分離成單細胞后

3、重新培養(yǎng)，單個的細胞又很快變成細胞球。免疫組化結(jié)果顯示這些細胞表達nestin,證實為神經(jīng)干細胞 實驗二褪黑素對鼠脊髓源性神經(jīng)干細胞增殖及分化的影響 取生長狀態(tài)良好的脊髓NSCs，加入終濃度為100μmol/L、1μmol/L 及10nmol/L 的褪黑素（melatonin ,MT），采用細胞計數(shù)結(jié)合免疫熒光檢測法，觀察NSCs 的生長增殖及分化狀況。結(jié)果顯示：100μmol/L 的MT 和1μmol/L的MT 均能促

4、進脊髓NSCs 增殖；10nmol/L 的MT 則抑制脊髓NSCs 增殖。3種濃度的MT 均能使脊髓NSCs 向神經(jīng)元分化的比率增加[對照組和實驗組的神經(jīng)元分化比率分別為(23.6±2)％，(45.3±1)％，(42.5±2)％，(50.7±2)％] 。結(jié)論：3 種不同濃度的褪黑素對大鼠脊髓NSCs 體外增殖有著不同的作用，但都促進其向神經(jīng)元分化。 實驗三褪黑素與全反式維甲酸聯(lián)合作用對胚胎大鼠脊髓神經(jīng)干細胞分化的影響 在

5、實驗一基礎上，取第4 代純化脊髓NSCs 經(jīng)吹打分離成單細胞懸液，適當密度接種于未包被25cm2 玻璃培養(yǎng)瓶，加入全反式維甲酸（all-transretinoic acid ,ATRA ）與不同濃度的MT 組合．觀察NSCs 分化狀況，細胞免疫化學熒光方法進行分化細胞類型鑒定，計算各組神經(jīng)元分化比例，并進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果：與對照組[(8.8±1 )％]比，單純ATRA 作用組神經(jīng)元分化比率[(10.6±2) ％]無明顯差異;單純MT

6、作用組100μmol/L[(24.8±2) ％]與10nmol/L MT[(23.4±1) ％]兩組都能明顯促進脊髓NSCs 向神經(jīng)元分化，兩組間比較無明顯差異；ATRA 與100μmol/L MT 共同作用組[(53.9±2)％]，進一步提高了脊髓NSCs 向神經(jīng)元分化的比率；ATRA 與10nmol/L MT 共同作用組[(26.7±2)％]也能促進脊髓NSCs 向神經(jīng)元方向分化（與對照組相比較），但其分化率與單一使用MT 的兩組比