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文檔簡介
1、禽流感病毒(AIV)屬正粘病毒科,單股負(fù)鏈的RNA病毒。近年來,不斷出現(xiàn)禽流感病毒感染人的新亞型。目前可感染人的AIV包括H5N1、H6N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7和 H10N8,其中 H10N8、H7N9、H6N1是2013年首次發(fā)現(xiàn)的可感染人的AIV亞型。禽流感病毒(AIV)在世界范圍內(nèi)尤其在亞洲廣泛流行,給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)對人類的公共衛(wèi)生安全也產(chǎn)生了一定的威脅。1965年利H1
2、0N8亞型AIV首次在意大利的鵪鶉體內(nèi)被分離到,中國第一次分離到H10N8亞型AIV是在2007年洞庭湖水樣調(diào)查中,在2012年在廣東省的鴨體內(nèi)同樣分離到了該病毒。2013年12月中國江西省發(fā)生了首例H10N8亞型禽流感病毒感染人的病例,在此之前H10N8亞型禽流感的遺傳背景還不清晰。為此本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了相關(guān)研究。
2013年12月本實(shí)驗(yàn)室在感染 H10N8的患者及活禽交易市場分離了三株H10N8禽流感病毒株,分別是A/Jian
3、gxi-Donghu/346-1、A/Jiangxi-Donghu/346-2和A/chicken/Jiangxi/102/2013。本研究對這三個(gè)病毒株進(jìn)行了遺傳演化分析,推測了該病毒的起源,H10和N8首先在野鳥中發(fā)生重組,因?yàn)椴《镜腍10和N8都在鴨子當(dāng)中分離到,所以最有可能是在野鴨中發(fā)生重組,繼而在雞體內(nèi)與H9N2亞型流感病毒發(fā)生重組,并且通過重組獲得了 H9N2的內(nèi)部基因。研究發(fā)現(xiàn)A/Jiangxi-Donghu/346-1、
4、A/Jiangxi-Donghu/346-2和 A/chicken/Jiangxi/102/2013三株病毒的HA、NA、PA、NP、M和NS基因具有相同的來源,且這三株毒的PB2、PB1、PA、NP、M和NS均來自雞H9N2亞型禽流感病毒。流感病毒根據(jù)NA序列的不同可分為N1型和N2型,N1型包括N1、N4、N5和N8,N2型包括N2、N3、N6、N7和 N9。本研究的N8屬于N1型流感病毒,N1型流感病毒對奧司他韋的耐藥突變通常在第
5、275位發(fā)生由H到K的變化,對N1型流感病毒來講在292位的耐藥突變出現(xiàn)的情況比較少。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn),在經(jīng)奧司他韋治療4天后,H10N8毒株NA片段第292位出現(xiàn)由R到K的耐藥突變。
反向遺傳技術(shù)是相對于經(jīng)典遺傳技術(shù)而言的,就是對生物體從基因水平上進(jìn)行操作,然后確定對生物體表型和性狀的影響。病毒的反向遺傳技術(shù),通常被稱為病毒拯救,是通過構(gòu)建RNA病毒的感染性分析克隆,在DNA分子水平上對其進(jìn)行體外操作,從而研究病毒結(jié)構(gòu)與功能的
6、方法。本研究利用 RT-PCR擴(kuò)增RNA病毒基因組的cDNA片段,然后利用利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),將其克隆于pHW2000載體,獲得基因組全長cDNA克隆,將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,全基因組 cDNA在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制并產(chǎn)生病毒的所有組分,最后包裝成具有感染性的病毒離子。本研究成功建立H10N8亞型禽流感病毒的反向遺傳系統(tǒng),拯救出帶有遺傳標(biāo)記的H10N8亞型禽流感毒株r346-1、r346-2和r102,并在SPF雞胚中5代,測定重組
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