我國(guó)11株H5N2亞型AIV的基因特征及對(duì)禽的致病性研究.pdf

1、自1983年，美國(guó)賓夕法尼亞州雞體內(nèi)首次出現(xiàn)H5N2亞型禽流感病毒（Avianinfluenza virus，AIV）至今，H5N2亞型禽流感病毒已在世界范圍內(nèi)廣泛流行，并引起不同程度的禽流感疫情。我國(guó)于2005-2006年在江西省鄱陽(yáng)湖和黑龍江省扎龍濕地的正常野鴨體內(nèi)分離到11株H5N2亞型禽流感病毒。為了解我國(guó)野生水禽攜帶的H5N2亞型禽流感病毒的生物學(xué)特性與致病性，本研究首先對(duì)這11株H5N2亞型禽流感病毒進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定、

2、同源性比較及遺傳演化分析；在此基礎(chǔ)上就分離自不同地域的病毒代表株對(duì)家禽的感染和致病能力進(jìn)行了評(píng)估。
　　 病毒的全基因組序列測(cè)定、同源性比較及遺傳演化分析：利用Trizol Ls RNA提取試劑盒從各病毒株感染的雞胚尿囊液中提取RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增所有毒株各個(gè)基因片段的cDNA。產(chǎn)物經(jīng)純化后在CEQ8000基因測(cè)序儀上進(jìn)行序列測(cè)定。用DNASTAR分析軟件包進(jìn)行序列的數(shù)據(jù)編輯、翻譯、進(jìn)化樹的繪制和遺傳演化分析。結(jié)果表

3、明，11株H5N2亞型禽流感病毒同屬于歐亞種系，并且可以劃分為6個(gè)基因型。2005年分離自江西省的10株H5N2亞型禽流感病毒HA基因裂解位點(diǎn)均具有4～6個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，具有高致病性禽流感病毒HA蛋白裂解位點(diǎn)的基因特征。10株病毒的HA、NA、PA和NP基因核苷酸和氨基酸的同源率較高，在95％-100％和93.9％-98.4％之間；并且10株病毒的HA、NP和NS基因與引起我國(guó)2004-2005年南方家禽流感疫情的高致病性禽流感病毒

4、代表株DK/JX/25/04（H5N1）的核苷酸最高同源率都在97.7％以上。2006年分離自黑龍江省的1株H5N2亞型禽流感病毒HA基因裂解位點(diǎn)為R-E-T-R，屬于典型的H5亞型低致病力毒株；該毒株在核苷酸同源性上與江西省的10株病毒差異較大。遺傳進(jìn)化上，11株病毒的HA、NA、PB1、PA和NS基因進(jìn)化關(guān)系較近，但分別以不同的毒株為祖先進(jìn)化而來(lái)，PB2、NP和M基因在各自的進(jìn)化關(guān)系上距離較遠(yuǎn)。另外，江西省的10株病毒在HA和PA基

5、因進(jìn)化關(guān)系上與2004-2005年我國(guó)南方家禽中流行的H5N1高致病性禽流感病毒較近，都以GS/GD/1/96（H5N1）為祖先進(jìn)化而來(lái)。
　　 代表毒株對(duì)家禽的感染和致病能力評(píng)估：感染實(shí)驗(yàn)以106EID50的病毒量鼻腔感染SPF雞和SPF鴨后，于第3、5天分別剖殺感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3只，采集喉頭拭子、泄殖腔拭子和各組織臟器，進(jìn)行病毒含量滴定和病理組織學(xué)觀察。致病力實(shí)驗(yàn)采用國(guó)際OIE IVPI方法，10倍稀釋病毒感染的雞胚尿囊液，0

6、.2 mL/只靜脈接種4周齡SPF雞和SPF鴨各10只，觀察10天。結(jié)果表明：分離自江西省的10株H5N2亞型禽流感病毒的代表株Mallard/JX/I16/05對(duì)SPF雞和SPF鴨的IVPI分別為3.0和2.42，均大于1.2，表現(xiàn)出很強(qiáng)的致病能力。而分離自黑龍江省Mallard/HLJ/134/06毒株對(duì)SPF雞和SPF鴨均不表現(xiàn)任何臨床癥狀。鼻腔感染SPF雞和SPF鴨后，Mallard/JX/I16/05毒株對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)出很高的

7、致死率，且表現(xiàn)出典型的神經(jīng)癥狀，剖檢可見腦膜點(diǎn)狀出血，胸腺出血、腫脹，肝臟腫大、呈淡土黃色，肺臟表面出血、充血，脾臟腫大出血。病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)大腦呈典型的病毒性腦炎病變，全身各器官以出血、充血、細(xì)胞變性壞死和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征。喉頭及泄殖腔拭子和各臟器均可分離到病毒。而Mallard/HLJ/134/06毒株對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致死率為0，且無(wú)臨床癥狀，除了能在氣管和法氏囊分離到少量的病毒外，其他器官均分離不到病毒。但攻毒后21天，感染和