中國(guó)人PRKAG2心臟綜合征家系致病基因新突變PRKAG2 G100S的功能研究.pdf

1、研究背景：PRKAG2心臟綜合征家系呈家族遺傳性，屬常染色體顯性遺傳；特點(diǎn)是家系成員可出現(xiàn)多種復(fù)雜的心臟病變，以心肌肥厚、傳導(dǎo)系統(tǒng)異常及心室預(yù)激為主要表現(xiàn)。目前國(guó)外共報(bào)告了17個(gè)該病家系的致病基因分析，研究發(fā)現(xiàn)與PRKAG2基因突變有關(guān)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的9種突變包括8種錯(cuò)義突變：Arg302Gln、His383Arg、Thr400Asn、Tyr487 His、Asn488Ile、Gln506Lys、Arg531Gly、Ser548Pro及一種

2、移碼突變Ins Leu351，他們都集中在PRKAG2的Bateman區(qū)域。家系的致病基因分析報(bào)道中，PRKAG2基因最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是R302Q，已在9個(gè)家系和1名散發(fā)患者中檢測(cè)到該突變。國(guó)內(nèi)洪奎報(bào)道的中國(guó)人家系存在PRKAG2 R302Q突變，未發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)。我科張靜博士報(bào)道的中國(guó)人大家系臨床表現(xiàn)有心肌肥厚(56％)、預(yù)激綜合征(46％)、竇房結(jié)功能不良或高度房室傳導(dǎo)阻滯、猝死，有的還伴有房顫、房撲等房性心律失常。家系的臨床表型

3、符合國(guó)外家系報(bào)道的共性，對(duì)家系成員進(jìn)行PRKAG2基因測(cè)序，在外顯子3上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的錯(cuò)義突變G100S，這個(gè)突變是國(guó)內(nèi)外從來(lái)沒(méi)有報(bào)道過(guò)的。 目前，國(guó)外對(duì)PRKAG2基因的致病機(jī)制研究已經(jīng)取得了令人矚目的成績(jī)，國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。早期一些人認(rèn)為PRKAG2突變引起能量缺乏，另一些人則認(rèn)為膜電流異?；蚧虮磉_(dá)異常/心臟發(fā)育異常導(dǎo)致了心肌病。然而，隨后的研究表明：PRKAG2心臟綜合征是一種特殊類型的糖原累積性心肌病。在轉(zhuǎn)基因小鼠

4、模型和人類疾病中貯積的糖類分析證明了這種心肌病中的糖原積累。攜帶PRKAG2 N488I錯(cuò)義突變的小鼠心臟糖原顯著增多。隨后，PRKAG2突變改變AMPK活性的研究解釋了疾病顯性遺傳的模式、心臟糖原積累及傳導(dǎo)系統(tǒng)中預(yù)激的表現(xiàn)型。為了驗(yàn)證PRKAG2 G100S新突變?cè)谥袊?guó)人PRKAG2心臟綜合征家系中的致病作用，深入認(rèn)識(shí)PRKAG2 G100S錯(cuò)義突變引起的功能變化，推動(dòng)PRKAG2基因的致病機(jī)制研究，我們通過(guò)在CCL13細(xì)胞中過(guò)表達(dá)突

5、變基因，從細(xì)胞、分子水平研究了PRKAG2 G100S突變的生物學(xué)功能。 研究目的：研究基因PRKAG2 G100S新錯(cuò)義突變的功能，探討該突變?cè)谥袊?guó)人家族性傳導(dǎo)系統(tǒng)異常伴心室預(yù)激及心肌肥厚家系中的發(fā)病機(jī)制。 研究方法：(1)人PRKAG2全長(zhǎng)基因的體外拼接及TA克隆載體的構(gòu)建：通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)得PRKAG2基因的一個(gè)轉(zhuǎn)錄變體cDNA質(zhì)粒(GenBank登記號(hào)BC068598)，其N端缺失了44個(gè)氨基酸，根據(jù)已知的PRKA

6、G2基因序列(GenBank登記號(hào)NM016203)，設(shè)計(jì)搭橋引物及序列擴(kuò)增引物，通過(guò)PCR搭橋方法，合成完整全長(zhǎng)序列的PRKAG2基因，并將其克隆到TA載體，得到的陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序鑒定。(2)攜帶野生型及突變型PRKAG2基因的重組慢病毒載體構(gòu)建及鑒定：以PRKAG2基因?yàn)槟０澹肞CR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變，設(shè)計(jì)4對(duì)引物，將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物上，通過(guò)PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段上含有所需要的突變位點(diǎn)，最后將擴(kuò)增片段GS、RQ及正常PRKAG2

7、基因(WT)克隆到慢病毒穿梭質(zhì)粒pWPT內(nèi)，構(gòu)建表達(dá)PRKAG2G100S、PRKAG2 R302Q及野生型PRKAG2基因的慢病毒載體，使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，并通過(guò)序列分析進(jìn)行確證。(3)攜帶野生型及突變型PRKAG2基因的重組慢病毒載體的體外實(shí)驗(yàn)研究：包裝慢病毒并感染CCL13細(xì)胞，建立過(guò)表達(dá)野生型及兩種突變型PRKAG2基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(CCL13/WT、CCL13/GS、CCL13/RQ)，并以PRKAG2 R302Q為

8、陽(yáng)性對(duì)照，PRKAG2正?；?yàn)殛幮詫?duì)照，未表達(dá)外源基因的CCL13細(xì)胞為空白對(duì)照，分別行FACS檢測(cè)慢病毒感染情況、Western Blot分析檢測(cè)PRKAG2表達(dá)、免疫熒光檢測(cè)野生型和突變型PRKAG2基因在細(xì)胞中的定位、MTT檢測(cè)基因突變對(duì)細(xì)胞增殖的影響、PAS染色檢測(cè)糖原含量、ELISA方法檢測(cè)AMPK的活性，從細(xì)胞水平初步研究PRKAG2 G100S新突變的功能結(jié)果。 結(jié)果：(1)拼接出全長(zhǎng)1707bp的PRKAG2基

9、因，目的基因連接到載體后測(cè)序與設(shè)計(jì)的PRKAG2基因完全一致。(2)在預(yù)期位點(diǎn)已經(jīng)發(fā)生突變，904處堿基由A→C，905處堿基由G→A，使PRKAG2基因第302位密碼子由精氨酸(R)突變?yōu)楣劝滨０?Q)；298位點(diǎn)發(fā)生G→A的突變，使PRKAG2基因第100位密碼子由甘氨酸(G)突變?yōu)榻z氨酸(S)。成功的構(gòu)建了pWPT-RQ(PRKAG2 R302Q)、pWPT-GS(PRKAG2G100S)、pwPT-WT(PRKAG2)穿梭載體，

10、酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果正確。(3)成功建立了過(guò)表達(dá)正?；騼煞N突變PRKAG2基因的CCL13細(xì)胞模型(CCL13/WT、CCL13/GS、CCL13/RQ)；FACS顯示慢病毒成功感染CCL13，各組均有PRKAG2表達(dá)。Western Blot分析提示：突變組CCL13/GS、CCL13/RQ與CCL13/WT組相比，PRKAG2蛋白表達(dá)量明顯減少，表明PRKAG2 G100S、R302Q突變使PRKAG2在CCL13細(xì)胞中表達(dá)減少；突變

11、組CCL13/GS與CCL13/RQ比較，CCL13/GS組PRKAG2蛋白量稍高于CCL13/RQ組；以上結(jié)果提示PRKAG2 G100S、R302Q突變阻礙了基因的正常表達(dá)，PRKAG2 G100S突變的阻礙作用弱于PRKAG2 R302Q突變。免疫熒光可以觀察到野生型及兩種突變型PRKAG2定位于CCL13細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，表明PRKAG2 G100S、PRKAG2 R302Q突變對(duì)PRKAG2基因在CCL13細(xì)胞中的表達(dá)位置沒(méi)有

12、影響。MTT檢測(cè)顯示在0.5mM AICAR分別作用30分鐘、90分鐘、24小時(shí)后，CCL13/GS組(30min：2.8157±0.0325：90min：2.7223±0.0740；24h：2.5520±0.0110)、CCL13/RQ組(30min：2.8230±0.0251：90min：2.6193±0.0560；24h：2.5467±0.0045)、CCL13/WT組(30min：2.7200±0.0556；90min：2.70

13、10±0.0030；24h：2.5597±0.0071)細(xì)胞增殖顯著高于空白對(duì)照CCL13組(30min：1.4547±0.0032；90min：1.2657±0.0015；24h：1.0253±0.2018)(P＜0.01)，而突變組(CCL13/GS及CCL13/RQ)與表達(dá)正常PRKAG2基因組(CCL13/WT)間細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異(P＞0.05)。PRKAG2 G100S、PRKAG2 R302Q突變使CCL13細(xì)胞漿及胞核內(nèi)

14、有較多糖原沉積，而未突變組(CCL13/WT、CCL13)糖原沉積較少。加入AMPK激活劑AICAR后，隨著加入AICAR濃度的增加，各組內(nèi)AMPK的濃度隨之增加，提示AMPK的濃度與活性是相對(duì)應(yīng)的。而無(wú)論是否加入AICAR，突變的CCL13/GS組(加前：13.6240±0.1310；0.5mMAICAR：19.5847±0.4711：2mMAICAR：22.4957±0.9460)及CCL13/RQ組(加前：12.6133±0.11

15、58；0.5mM AICAR：17.3713±0.9644；2mM AICAR：19.3697±0.4264)與非突變的CL13/WT組(加前：25.4903±0.8947；0.5mMAICAR：31.5990±0.6950；2mM AICAR：34.7823±0.2081)及CCL13組(加前：4.9363±1.0655；0.5mM AICAR：6.4203±0.9160；2mM AICAR：7.3463±0.9451)中AMPK的活

16、性有顯著差異(P＜0.01)，而兩個(gè)突變組CCL13/GS、CCL13/RQ之間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，表明PRKAG2基因G100S、R302Q突變降低了CCL13細(xì)胞中的AMPK活性，而G100S突變降低AMPK活性的作用弱于R302Q突變。 結(jié)論：(1)PRKAG2 G100S突變導(dǎo)致PRKAG2基因生物學(xué)功能發(fā)生變化，驗(yàn)證了PRKAG2 G100S突變是中國(guó)人PRKAG2心臟綜合征家系的發(fā)病原因，初步證實(shí)了突變導(dǎo)