恒定磁場對Schwann細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：長期以來，周圍神經(jīng)病變嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量，是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中的一個(gè)復(fù)雜但十分重要的病變過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)理之一是氧化應(yīng)激引起氧自由基增多，從而導(dǎo)致Schwann細(xì)胞的凋亡。Schwann細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的膠質(zhì)細(xì)胞，包繞軸突形成有髓纖維或無髓纖維，并分泌多種與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和再生密切相關(guān)的因子。近年來，通過外界因素(如各種神經(jīng)生長因子、中藥、電磁場、硅膠管及其他移植物等)干預(yù)Schwann細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)周圍

2、神經(jīng)損傷后再生的研究日趨增多。 古今中外大量資料表明，磁場具有治病健身的作用。迄今已證實(shí)，外加磁場主要通過影響細(xì)胞類脂液晶膜層及細(xì)胞間的協(xié)調(diào)整合關(guān)系，對機(jī)體產(chǎn)生治病健身的作用。磁場通過多種方式應(yīng)用于臨床，如：靜磁療法、復(fù)合磁療法、經(jīng)絡(luò)磁療法和磁水療法等。磁療技術(shù)具有操作簡單、見效快、副作用小、無痛苦等優(yōu)點(diǎn)，能治療多種疾病，如婦女痛經(jīng)、頸椎病、癲癇病、精神疾病、青光眼、白內(nèi)障、高血壓和偏頭痛等。磁場不僅能夠促進(jìn)毛細(xì)血管增生、促進(jìn)表

3、皮生長、加速潰瘍愈合，還可以調(diào)整心血管功能，改善心臟病的血液循環(huán)，緩解心絞痛等。磁療水可增加細(xì)胞的滲透性，提高消化酶的活性，增強(qiáng)消化功能；對結(jié)石的形成有抑制作用，對已形成的結(jié)石有溶解、促排作用，能治療膽結(jié)石、胰腺結(jié)石、泌尿結(jié)石等。 根據(jù)磁場與時(shí)間的關(guān)系，磁場可分為恒定磁場和變動(dòng)磁場。恒定磁場具有恒定的磁場強(qiáng)度，是最基本、最簡單的一種磁場，適合作基礎(chǔ)性研究。目前，磁療技術(shù)已在臨床上廣泛應(yīng)用，但是人們對磁場治療疾病的機(jī)理的認(rèn)識還十分

4、有限，而恒定磁場對Schwann細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用及其機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。 本課題通過建立過氧化氫誘導(dǎo)的Schwann細(xì)胞氧化損傷模型，并在此模型的基礎(chǔ)上，觀察4mT恒定磁場對氧化損傷的Schwann細(xì)胞的保護(hù)作用，通過MTT、生化檢測、免疫組化等方法進(jìn)行細(xì)胞活力測定、酶活力分析、Caspase-3的表達(dá)，探討恒定磁場抗氧化損傷的作用機(jī)理，為揭示恒定磁場治療周圍神經(jīng)病變的機(jī)制提供理論依據(jù)。方法：本課題以72小時(shí)內(nèi)新生Wist

5、ar大鼠的坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)為實(shí)驗(yàn)材料，用含10﹪胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液于5﹪CO<,2>、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Schwann細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)一空白對照組。 1．4mT恒定磁場的準(zhǔn)備將兩塊磁鐵上下依次放置，利用特斯拉計(jì)測定二者之間的空間磁場強(qiáng)度為4mT，然后將其放置于5﹪CO<,2>、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。 2．Schwann細(xì)胞的純化及鑒定阿糖胞苷抑制成纖維細(xì)胞及

6、傳代純化雪旺細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前雪旺細(xì)胞爬片S-100免疫組化染色，鑒定雪旺細(xì)胞。 3．氧化損傷處理及恒定磁場處理細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)分三組：①過氧化氫損傷組：終濃度為100μmol/L；②過氧化氫+恒定磁場保護(hù)組：100mol/L H<,2>O<,2+>恒定磁場；③正常組(不加任何因素)；同時(shí)設(shè)僅加培養(yǎng)液的空白對照組。 4．MTT法進(jìn)行恒定磁場抗過氧化氫氧化損傷的作用分析。 5．生化檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物MDA和超氧化物歧化酶S

7、OD水平。 6．應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，測定正常對照組、過氧化氫損傷組及恒定磁場保護(hù)組三組細(xì)胞Caspase-3蛋白酶的變化。 通過以上的實(shí)驗(yàn)，建立了過氧化氫誘導(dǎo)Schwann細(xì)胞的氧化損傷模型，在此模型的基礎(chǔ)上探討4mT恒定磁場對Schwann細(xì)胞抗氧化損傷保護(hù)作用的機(jī)理。 結(jié)果：剛接種的原代Schwann細(xì)胞呈圓形，懸浮在培養(yǎng)液中，接種6h后大部分細(xì)胞貼壁，部分細(xì)胞開始呈橢圓形，24h后變成雙極，胞體飽滿，立體

8、感強(qiáng)，少數(shù)呈三角形，伸出三個(gè)突起。培養(yǎng)48～72h后，出現(xiàn)聚合現(xiàn)象，許多細(xì)胞聚合在一起呈端對端、肩并肩、漩渦狀或柵欄狀排列，在細(xì)胞密度較低時(shí)，則聚集成堆，形成“細(xì)胞島?！保庖呒?xì)胞化學(xué)染色為S-100陽性；另一種細(xì)胞稍大，外形不規(guī)則，呈扁平狀，突起短而多，核較淺，為成纖維細(xì)胞，所占比例較低。培養(yǎng)24小時(shí)后加終濃度為10<'-5> mol/L的阿糖胞苷，48小時(shí)后換液去除阿糖胞苷，鏡下觀察Schwann細(xì)胞的純度明顯增加，免疫化學(xué)染色顯示

9、80﹪以上的細(xì)胞S-100呈陽性反應(yīng)。加入H<,2>O<,2>12小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞突起萎縮，胞體腫脹變圓，細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞脫壁漂浮于培養(yǎng)液中，胞體立體感差，折光度下降，并可見大量細(xì)胞碎片；恒定磁場保護(hù)組的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，胞體飽滿立體感強(qiáng)，少見細(xì)胞皺縮破碎現(xiàn)象，但細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象較明顯；正常組的細(xì)胞狀態(tài)長勢很好。不同實(shí)驗(yàn)組檢測結(jié)果如下： 1．MTT法進(jìn)行恒定磁場抗氧化損傷的作用分析表明：恒

10、定磁場可明顯拮抗過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷，與過氧化氫損傷組相比，恒定磁場保護(hù)組可維持較高的細(xì)胞存活率，二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，恒定磁場保護(hù)組的細(xì)胞細(xì)胞存活率雖然低于正常組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2．生化檢測表明：與過氧化氫損傷組相比，恒定磁場保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)維持在較高的活力水平，表明恒定磁場可明顯拮抗過氧化氫引起的SOD降低；同時(shí)低于正常對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3．生化檢測表明

11、：與正常組相比，過氧化氫引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的大量堆積，而恒定磁場可明顯降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的含量(P<0.05)。 4．免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的表達(dá)：正常組Schwan細(xì)胞的Caspase-3反應(yīng)呈弱陽性，細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒幾乎沒有；過氧化氫損傷組呈強(qiáng)陽性，可見到陽性的棕色顆粒；恒定磁場保護(hù)組呈弱陽性，棕色顆粒很少。 結(jié)論：我們以原代培養(yǎng)的Schwann細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，過氧化氫誘導(dǎo)Schwann細(xì)胞

12、的氧化損傷為模型，在此模型的基礎(chǔ)上，觀察過氧化氫誘導(dǎo)Schwann細(xì)胞的氧化損傷作用及恒定磁場對氧化損傷的Schwann細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過氧化氫損傷能夠引起細(xì)胞內(nèi)自由基的增多，SOD活力的降低，脂質(zhì)過氧化物的增多，并且自由基的增多能通過信號通路上Caspase-3最終引起細(xì)胞的凋亡；恒定磁場則能夠降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物(MDA)的含量，維持細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的含量，還能通過降低凋亡蛋白酶Caspase-3來影響