五種致腹瀉大腸埃希菌的多重PCR檢測研究.pdf

1、腹瀉是一種世界流行性疾病，在衛(wèi)生條件比較落后的地區(qū)發(fā)病率較高，而且具有明顯的季節(jié)性。在我國，感染性腹瀉的發(fā)病率居所有傳染病之首。我們的監(jiān)測結(jié)果顯示，腹瀉病原菌中致腹瀉大腸埃希菌所占的比例呈上升的趨勢。臨床上對致腹瀉病原菌的檢測主要應(yīng)用常規(guī)微生物分離及生化鑒定，費時費力，缺乏試劑，標(biāo)準(zhǔn)不一，很難適應(yīng)快速檢測與鑒定的需要。雖然分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到傳染病病原的檢測，但操作復(fù)雜、試劑不齊全且不穩(wěn)定，限制了分子生物學(xué)技術(shù)在臨床上推廣。就致腹瀉

2、大腸埃希菌而言，還沒有比較成熟的、能同時鑒別不同型別菌株的分子生物學(xué)方法。本研究旨在建立一種同時檢測五種致腹瀉大腸埃希菌的多重PCR方法，探索影響多重PCR擴增的因素；探討模擬糞便標(biāo)本的前處理方法，將建立的多重PCR方法應(yīng)用于檢測臨床分離菌株以及模擬糞便標(biāo)本，對多重PCR方法進行評價，使多重PCR方法能夠直接從臨床標(biāo)本中檢測與鑒別相應(yīng)的致腹瀉大腸埃希菌。 本研究應(yīng)用DNAStar軟件，針對五種致腹瀉大腸埃希菌EAEC、EHEC、

3、EIEC、EPEC、ETEC的毒力相關(guān)基因設(shè)計并驗證相應(yīng)的引物，建立了檢測五種致腹瀉大腸埃希菌的單重PCR方法。單重PCR能夠快速、敏感、特異地鑒別出五種致腹瀉大腸埃希菌，每個反應(yīng)中能檢測到的最低菌量不一，敏感性也從51 CFU/反應(yīng)到1.31×10<'5>CFU/反應(yīng)不等。 在單重PCR方法的基礎(chǔ)上，通過調(diào)整影響多重PCR擴增的主要因素，系統(tǒng)探索和優(yōu)化反應(yīng)條件，使一步PCR能夠同時鑒定五種大腸埃希菌，獲得比較好的擴增結(jié)果，建立

4、了能夠同時檢測的多重PCR方法。其敏感性比相應(yīng)的單重PCR略低。通過對不同菌株進行擴增，驗證了此方法的特異性，與單重PCR比較并鑒定了16株致腹瀉大腸埃希菌分離株，15株的檢測結(jié)果相互吻合，只有一株EIEC菌株用多重PCR擴增為陰性，與單重PCR符合率為93.8％。 以EAEC標(biāo)準(zhǔn)菌株為代表株，制備含有EAEC單一菌株的模擬糞便標(biāo)本，選擇不同的處理方法，對模擬糞便標(biāo)本進行前期處理，以獲得細菌DNA。用單重PCR對提取的相應(yīng)模擬糞

5、便標(biāo)本的模板進行擴增，評價并確定模擬糞便標(biāo)本前處理方法。通過比較七種模擬糞便標(biāo)本的前處理方法，最終篩選出適用于PCR擴增的處理模擬糞便標(biāo)本方法。其中，集菌煮沸后純化法、集菌后提取基因組法、直接煮沸后純化法、試劑盒法制備的模板均可以用于單重PCR擴增，前兩種方法在模擬標(biāo)本離心后，沉淀與上清的界限不夠明顯，易形成糞便懸濁液，實驗結(jié)果與實驗人員操作密切相關(guān)；試劑盒方法根據(jù)操作手冊提取，重復(fù)性好，但需要耗費的時間較長，操作過程復(fù)雜，成本較高；直

6、接煮沸后純化的方法操作簡便、快速、重復(fù)性好。綜合分析，用單重PCR方法進行擴增時，直接煮沸后純化法是標(biāo)本處理的首選方法。實驗室制備含有五種致腹瀉大腸埃希菌的模擬標(biāo)本，分別用直接煮沸后純化法和試劑盒法提取模擬標(biāo)本中的總核酸，多重PCR方法擴增結(jié)果表明，試劑盒方法明顯優(yōu)于直接煮沸后純化核酸的方法，是進行多重PCR前處理模擬糞便標(biāo)本的首選方法。 將模擬標(biāo)本接種LB培養(yǎng)基，增菌4～6h后用煮沸法制取模板，每個反應(yīng)中能檢測到的模板量相當(dāng)于