Caco-2細(xì)胞對自組裝海藻酸鈉納米粒的攝入研究.pdf

1、目的：研究Caco-2細(xì)胞對異硫氰基熒光素(FITC)標(biāo)記的自組裝海藻酸鈉納米粒(sSAN-FITC)及負(fù)載維生素D3的自組裝海藻酸鈉納米粒(sSAN-VD3-FITC)的攝取及其影響因素，分析sSAN-FITC及sSAN-VD3-FITC通過Caco-2細(xì)胞吸收模型的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)。 方法：1.采用熒光多功能連續(xù)光譜酶聯(lián)免疫分析儀（熒光酶標(biāo)儀）檢測細(xì)胞內(nèi)FITC的熒光強(qiáng)度，觀察分析sSAN-FITC濃度、作用時(shí)間、pH值改變對C

2、aco-2細(xì)胞攝入sSAN-FITC的影響。2.采用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡檢測Caco-2細(xì)胞對sSAN-FITC及sSAN-VD3-FITC的攝取，并分析作用時(shí)間對攝入的影響；3.采用Caco-2細(xì)胞吸收模型研究sSAN-FITC、sSAN-VD3-FITC的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，利用熒光酶標(biāo)儀檢測接受池內(nèi)溶液中FITC的熒光強(qiáng)度，觀察sSAN-FITC及sSAN-VD3-FITC從腸腔側(cè)(apical，AP)到基底側(cè)(basolateral，

3、BL)的轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)。計(jì)算跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)表觀滲透系數(shù)(Papp)，并分析作用時(shí)間對轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 結(jié)果：1.熒光酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示，加入sSAN-FITC后，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(p<0.01)，且有濃度依賴性和時(shí)間依賴性(p<0.01)；①與空白對照組相比，不同濃度（50、100、200、400μg/ml）的sSAN-FITC與Caco-2細(xì)胞共同作用2h后，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度均有不同程度的增強(qiáng)，其中200μg/ml組、400μg/ml組

4、細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)顯著(p<0.01)；而且與其他各濃度組比較差異顯著(p<0.05，p<0.01)，以400μg/ml組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度最高(p<0.001)。②sSAN-FITC與Caco-2細(xì)胞作用不同時(shí)間(1h、2h、4h)后細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)(p<0.01，p<0.001)；各時(shí)間組之間比較差異顯著(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。③溶液pH值影響Caco-2細(xì)胞對sSAN-FITC的攝入，當(dāng)溶液pH等于7

5、.0時(shí)，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度最低，當(dāng)pH值低于或高于7.0(6.0、6.5、7.4)時(shí)，熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)(p<0.01，p<0.05)；溶液pH為6.0時(shí)熒光強(qiáng)度最高(p<0.01)。2.熒光顯微鏡照片及激光共聚焦顯微鏡照片顯示，sSAN-FITC、sSAN-VD3-FITC可以被Caco-2細(xì)胞攝入，與細(xì)胞作用1h后，sSAN-FITC大量吸附在細(xì)胞膜上，在細(xì)胞周圍形成綠色熒光環(huán)，作用4h后細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量熒光顆粒，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；sSAN-

6、VD3-FITC與Caco-2細(xì)胞作用1h后胞漿內(nèi)即出現(xiàn)熒光顆粒，作用4h后，胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。3.跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：①AP-BL轉(zhuǎn)運(yùn)方向，sSAN-FITC與Caco-2細(xì)胞作用不同時(shí)間(0.5h、1h、2h、4h)后，接收液內(nèi)的熒光強(qiáng)度、藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量比空白對照組均有不同程度的增強(qiáng)(p<0.05，p<0.01)；作用4h后接收液的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)、轉(zhuǎn)運(yùn)量最多（與作用0.5h、1h、2h比較，p<0.01）；Papp隨著作用時(shí)間的

7、延長逐漸增大，在本實(shí)驗(yàn)研究范圍內(nèi)未有飽和現(xiàn)象。②sSAN-VD3-FITC的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果顯示，在AP-BL轉(zhuǎn)運(yùn)方向接收池內(nèi)液體中FITC的熒光強(qiáng)度、藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量與空白對照組比較均明顯升高，均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，并且均隨著作用時(shí)間的延長，接收液中熒光強(qiáng)度、藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯升高(p<0.01，p<0.05).AP-BL方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)Papp較穩(wěn)定，但隨作用時(shí)間的延長逐漸減??；③sSAN-FITC與sSAN-VD3-FI

8、TC的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)比較，0.5h時(shí)sSAN-VD3.FITC接受液內(nèi)熒光強(qiáng)度高于sSAN-FITC.p<0.05)。 結(jié)論：自組裝海藻酸鈉納米粒(sSAN)及負(fù)載維生素D3的自組裝海藻酸鈉納米粒（sSAN-VD3）均可被Caco-2細(xì)胞攝取，攝入時(shí)受藥物濃度、藥物作用時(shí)間以及藥物溶液pH值的影響，sSAN和sSAN-VD3均可以通過Caco-2細(xì)胞吸收模型從腸腔側(cè)到基底側(cè)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并存在時(shí)間依賴性，表明sSAN和sSAN-VD3