TCF4-β-catenin調(diào)控間充質(zhì)干細胞向HGF的趨化性遷移.pdf

1、組織損傷或神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴重影響著人類的生命健康和生活質(zhì)量，移植外源性干細胞修復受損部位或重塑神經(jīng)組織是目前治療這些疾病的主要策略，但神經(jīng)干細胞（neural stem cells, NSCs）或胚胎干細胞（embryonic stem cell, ESCs）由于來源和倫理等問題不能被廣泛應用于干細胞移植。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一類多潛能成體干細胞，因其具有來源廣泛、體外增殖快和免疫原性

2、弱等優(yōu)勢，迅速成為理想的組織工程種子細胞。體內(nèi)外實驗證實MSCs可以沿著趨化因子（HGF、VEGF、SDF）濃度梯度的方向向損傷部位遷移，修復受損的組織，但是關于細胞遷移的具體調(diào)控機制目前尚不清楚。Wnt/β-catenin信號通路不僅影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，對干細胞的增殖、分化和遷移同樣具有重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)許多細胞因子如HGF、VEGF等可以激活Wnt/β-catenin信號通路，影響細胞的分化和遷移，此過程中沒有 Wnt蛋

3、白的參與。本文旨在研究肝細胞生長因子（HGF）誘導MSCs趨化性遷移過程中，Wnt/β-catenin信號通路的激活情況以及轉(zhuǎn)錄因子TCF4在遷移過程中的作用，在此基礎上進一步揭示與遷移相關的Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄變化。此外本文還探討了Wnt/β-catenin信號通路對MSCs細胞骨架重排的影響。
　　本研究首先采用Percoll法從SD大鼠的骨髓中成功分離和純化MSCs，并以此細胞為實驗材料，檢測HGF對MSCs中Wnt/β-ca

4、tenin信號通路的影響。Western blot結(jié)果顯示HGF能夠增加MSCs中β-catenin蛋白的表達，具有劑量依賴性，50 ng/ml HGF使β-catenin的蛋白表達水平增加了2倍。接著我們用50 ng/ml HGF處理MSCs不同的時間，發(fā)現(xiàn)HGF處理30 min，MSCs中β-catenin表達開始增加，具有顯著性差異，一直到240 min MSCs中β-catenin仍處于較高的表達水平。免疫熒光染色結(jié)果顯示，50

5、 ng/ml HGF處理MSCs30 min，細胞質(zhì)中β-catenin開始累積，并具有向細胞核轉(zhuǎn)移的趨勢；處理60 min，β-catenin完全入核；在處理的240 min內(nèi)，β-catenin沒有明顯出核或降解跡象。此外，通過TOPFlash/FOPFlash雙熒光素酶報告基因檢測HGF處理MSCs后細胞中TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性的變化，與對照組相比，50 ng/ml HGF處理MSCs60 min，細胞中的TOPFlash報告基因

6、活性增加了4倍，但FOPFlash報告基因沒有明顯的變化。以上這些結(jié)果說明50 ng/ml HGF能夠激活MSCs中Wnt/β-catenin信號通路。
　　本實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)，HGF能夠誘導MSCs發(fā)生趨化性遷移，呈現(xiàn)劑量依賴性，50 ng/ml HGF使細胞的遷移總數(shù)達到最大值；為了檢測激活的Wnt/β-catenin信號通路是否參與MSCs向HGF的趨化性遷移過程，我們引入Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑FH53

7、5和激活劑LiCl，采用Boyden chamber裝置進行細胞群體性遷移的實驗研究。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑FH535明顯抑制了MSCs向HGF的遷移，其中5μM FH535使細胞的遷移總數(shù)下降了30%，20μM FH535使遷移總數(shù)的下降超過了50%；用LiCl激活Wnt/β-catenin信號通路則可以進一步促進MSCs向HGF的趨化性遷移。此外，我們利用Dunn chamber裝置檢測了FH535和LiCl對單細胞遷移軌跡的影響，結(jié)果

8、顯示，相比于對照組，F(xiàn)H535降低了MSCs向HGF遷移的速度和遷移效率；而LiCl增加了細胞的遷移速度，對遷移效率沒有明顯影響。
　　轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族在Wnt/β-catenin信號通路中起著分子開關的作用，因此接下來首先檢測MSCs中TCF/LEF的表達亞型，結(jié)果顯示雖然MSCs中TCF/LEF四種亞型的轉(zhuǎn)錄因子都有表達，但是 TCF4的相對表達水平遠遠高于其它三種亞型，并且50 ng/ml HGF處理MSCs60

9、min后，TCF4 mRNA和蛋白表達水平都明顯上升，一直持續(xù)到240 min。免疫熒光染色結(jié)果顯示50 ng/ml HGF處理MSCs60 min能顯著增加TCF4在細胞核內(nèi)的積累。對β-catenin和TCF4的共定位染色發(fā)現(xiàn)HGF在促進β-catenin聚集到細胞核的同時，核內(nèi)的TCF4也明顯增加，兩者呈現(xiàn)共定位關系。為進一步揭示TCF4在MSCs中的功能，我們構(gòu)建了TCF4全長以及缺失了與β-catenin結(jié)合序列的功能突變型重

10、組腺病毒載體，在QBI-293A中進行包裝和擴增，并篩選出重組腺病毒感染MSCs的最適病毒復數(shù)。
　　我們通過腺病毒載體感染的方法改變MSCs中TCF4的表達，并利用Boyden chamber和Dunn chamber裝置檢測腺病毒感染后MSCs向HGF趨化性遷移的變化。與空病毒即只含GFP的對照組相比，感染Ad-?TCF4后細胞的群體遷移數(shù)目顯著降低，而感染Ad-TCF4對MSCs遷移沒有明顯影響。Dunn chamber統(tǒng)計

11、結(jié)果顯示，感染Ad-?TCF4組細胞的遷移速度和遷移效率都顯著降低；而感染Ad-TCF4組對細胞的遷移速度和效率沒有明顯影響。此外，通過siRNA的方法下調(diào)MSCs中TCF4的表達也得到了與感染Ad-?TCF4一致的結(jié)果，siRNA下調(diào)TCF4的表達后，MSCs向HGF遷移的速度和FMI值都顯著下降。接著本文進一步研究了Wnt/β-catenin信號通路影響MSCs遷移的分子機制?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類遷移相關蛋白，能夠降解細

12、胞外基質(zhì)，促進細胞的遷移，先前的研究表明很多 MMPs都是Wnt/β-catenin信號通路的靶基因，在本文中我們檢測了HGF處理MSCs后MMP2、MMP7和MMP9轉(zhuǎn)錄水平的變化，因為這幾種蛋白在腫瘤的轉(zhuǎn)移中呈現(xiàn)較高的表達水平。結(jié)果顯示HGF顯著增加了MMP2的轉(zhuǎn)錄水平，對MMP7和MMP9的轉(zhuǎn)錄沒有明顯的影響，當MSCs感染Ad-?TCF4后，HGF誘導MMP2的轉(zhuǎn)錄增加被抑制了，表明HGF促進MMP2的轉(zhuǎn)錄是通過Wnt/β-ca

13、tenin信號通路完成的。
　　由于細胞遷移與細胞骨架的重排密切相關，我們最后檢測了Wnt/β-catenin信號通路在細胞骨架重排過程中的作用。通過對F-actin的免疫染色，發(fā)現(xiàn)HGF處理MSCs0.5 min時細胞周邊出現(xiàn)肌動蛋白聚集形成的片狀偽足，且應力纖維沿著極性方向整齊排列，而抑制劑FH535處理使細胞骨架重排時間推遲，在0.5 min-2 min之間，細胞內(nèi)部骨架散亂排布，處理5min后，部分細胞開始出現(xiàn)骨架的重排，

14、說明FH535的處理，使MSCs中細胞骨架重組對HGF的敏感性下降。
　　綜上所述，Wnt/β-catenin信號通路參與了MSCs向HGF的趨化性遷移過程，并通過其下游靶基因MMP2的轉(zhuǎn)錄促進細胞遷移，其中TCF4是主要的轉(zhuǎn)錄因子，影響細胞的群體性遷移數(shù)目、遷移速度和遷移效率。本實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)HGF激活MSCs中PI3K和MAPKs信號通路，本實驗研究表明Wnt/β-catenin信號通路也直接參與了MSCs向HGF的遷移行