CSNB大鼠致病基因的鑒別.pdf

1、視網(wǎng)膜是視覺信號(hào)產(chǎn)生和初步整合處理的部位，其病變嚴(yán)重影響患者的視覺功能，造成大量的盲和低視力。各種遺傳性視網(wǎng)膜疾病的模式動(dòng)物，不僅為闡明疾病的發(fā)病機(jī)理和尋找可能的治療方法提供了重要的模型，而且還為視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能研究提供了重要手段。我國尚沒有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的遺傳性視網(wǎng)膜疾病模式動(dòng)物。 2003年，我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一種視覺電生理表型與人類先天性靜止性夜盲(congenitalstationarynightblindness，CSNB

2、)相似的大鼠，其后又發(fā)現(xiàn)了一種與人類視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞功能不全(retinalconedysfunction，RCD)表型相似的大鼠。對(duì)這兩種大鼠我們實(shí)驗(yàn)室都進(jìn)行了近交繁殖，將其由Sprague-Dawley遠(yuǎn)交系培育為近交品系，以利于實(shí)驗(yàn)研究。 在課題的第一部分，我們對(duì)這兩種動(dòng)物的視覺電生理性狀進(jìn)行了觀察，包括：常規(guī)視覺電生理，CSNB大鼠的暗適應(yīng)多焦點(diǎn)視網(wǎng)膜電圖和明適應(yīng)多焦點(diǎn)視網(wǎng)膜電圖，RCD大鼠的不同顏色刺激光暗適應(yīng)多焦點(diǎn)視網(wǎng)

3、膜電圖。 常規(guī)視網(wǎng)膜電圖顯示CSNB大鼠暗適應(yīng)ERGb波消失，a波基本正常，OPs波消失，明適應(yīng)ERGb波潛伏期延長，幅值降低。RCD大鼠表現(xiàn)為暗適應(yīng)ERG正常，OPs正常，但明適應(yīng)ERG未能記錄出明顯波形。推測(cè)CSNB大鼠視桿系統(tǒng)功能完全喪失，視錐系統(tǒng)功能也受嚴(yán)重影響，而RCD大鼠視桿系統(tǒng)功能完好，視錐系統(tǒng)功能完全喪失，且兩者的病變部位都應(yīng)位于光感受器與二級(jí)神經(jīng)元之間。 CSNB大鼠暗適應(yīng)和明適應(yīng)多焦點(diǎn)視網(wǎng)膜電圖都顯示

4、其P1波潛伏期顯著延長，暗適應(yīng)多焦點(diǎn)視網(wǎng)膜電圖P1波的幅值也明顯降低。關(guān)于多焦點(diǎn)視網(wǎng)膜電圖的波形起源尚不十分清楚，有研究認(rèn)為P1波是由ON反應(yīng)和OFF反應(yīng)共同組成，由于從常規(guī)視網(wǎng)膜電圖分析CSNB大鼠的ON反應(yīng)喪失，因此我們推測(cè)得到的P1波可能是由較慢的OFF反應(yīng)成分組成。 RCD大鼠不同顏色光刺激暗適應(yīng)多焦點(diǎn)視網(wǎng)膜電圖的結(jié)果讓人困惑，高光強(qiáng)狀態(tài)下，綠光、藍(lán)光和白光刺激模式幾乎記錄不到明顯波形，而紅光刺激模式不受影響。大鼠視網(wǎng)膜

5、尚未報(bào)道有對(duì)長波長光敏感的光感受器，多位專家對(duì)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常感興趣，卻未能提出合理的解釋。 X染色體隱性遺傳CSNB根據(jù)其視覺電生理和臨床表現(xiàn)可以被分為完全型(CSNB1)和不完全型(CSNB2)，分別由NYX和CACNA1F基因突變致病。根據(jù)CSNB大鼠的視覺電生理特點(diǎn)尚不足以將其歸入任何一種亞型，因此為了尋找其致病基因，在第二部分實(shí)驗(yàn)中，我們克隆了正常大鼠的NYX和CACNA1F全長cDNA。 通過對(duì)人、小鼠和預(yù)

6、測(cè)大鼠序列進(jìn)行比對(duì)，得到了NYX和CACNA1F基因的保守區(qū)域，在這些區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)兼并引物，從正常大鼠視網(wǎng)膜中擴(kuò)增出NYX和CACNA1F的cDNA片段。再根據(jù)得到的片段設(shè)計(jì)基因特異性引物，使用cDNA末端快速擴(kuò)增方法(rapidamplificationofcDNAends，RACE)得到大鼠NYX和CACNA1F基因的全長cDNA序列。 NYX基因cDNA全長1971bp，提交Genbank獲得序列號(hào)DQ393414。生物信息

7、學(xué)分析表明，與人和小鼠的相應(yīng)基因的核酸和氨基酸序列有著很高的同源性；位于基因組Xq12，由3個(gè)外顯子組成；編碼蛋白含476個(gè)氨基酸，屬于小亮氨酸富集蛋白多糖家族(smallleucine-richproteoglycans，SLRPs)成員；N端存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，中間是11個(gè)亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)(1eucine-richrepeats，LRRs)，C端未發(fā)現(xiàn)人類存在的GPI錨著結(jié)構(gòu)；亞細(xì)胞定位認(rèn)為其位于細(xì)胞外，與細(xì)胞膜相連。該蛋白可能在一、

8、二級(jí)神經(jīng)元視覺信號(hào)的傳遞方面發(fā)揮作用。 CACNA1F基因cDNA全長6076bp，提交Genbank獲得序列號(hào)DQ393415。生物信息學(xué)分析表明，其與人和小鼠相應(yīng)基因的核酸和氨基酸序列有著很高的同源性；位于基因組Xq13，由49個(gè)外顯子所構(gòu)成。編碼蛋白含1980個(gè)氨基酸，屬于電壓依賴性鈣離子通道的一個(gè)亞基；含有4個(gè)離子通道蛋白結(jié)構(gòu)域(Iontransportprotein，Iontrans)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域中有6個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。

9、亞細(xì)胞定位其位于細(xì)胞膜上。該蛋白可能在光感受器終末為電壓依賴性鈣離子通道構(gòu)成了跨膜亞基。 得到了正常大鼠NYX和CACNA1F的全長cDNA序列后，在第三部分中，我們對(duì)CSNB大鼠兩種基因的全長cDNA進(jìn)行了分段擴(kuò)增并測(cè)序，結(jié)果在CACNA1F基因cDNA的2974位發(fā)現(xiàn)了C→T點(diǎn)突變，使第981號(hào)密碼子由CGA突變?yōu)門GA，編碼的精氨酸突變?yōu)榻K止碼。Northernblot結(jié)果顯示CACNA1FmRNA的表達(dá)在CSNB大鼠視網(wǎng)