Cyclopamine對銀屑病SCID小鼠模型的影響及其治療銀屑病機(jī)制的初步研究.pdf

1、銀屑病是皮膚科一種常見的、具有遺傳傾向的慢性炎癥性疾病。在外來抗原刺激下，人類白細(xì)胞分化抗原4+（Clusters of differentiation，CD4+）T細(xì)胞激活，分泌白介素（Interleukin，IL）-2、6、8，刺激角質(zhì)形成細(xì)胞（Keratinocyte，KC）增殖，被激活的KC可分泌IL-1、6、8，再作用于CD4+T細(xì)胞；或通過IL-6、8作用于自身，另外，活化的CD4+T細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α（Tumor ne

2、cros factor-alpha，TNF-α）、干擾素γ（gamma Interferon，IFN-γ）使KC分泌細(xì)胞間黏附分子（Intercellular adhesion molecule，ICAM）-1，介導(dǎo)KC與CD4+T細(xì)胞黏附，使病變周而復(fù)始。
　　Hedgehog（Hh）信號通路是一個調(diào)控胚胎發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，胚胎發(fā)育完成后仍可繼續(xù)調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖和分化。Hh信號通路的激活可以使KC表現(xiàn)出一些銀屑病的病理特點(diǎn)

3、，如使KC增殖、角化異常、角蛋白（Keratin，K）14表達(dá)水平增高、表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）磷酸化增加等。該信號通路的高效、特異性抑制劑cyclopamine，可以迅速清除銀屑病皮損，在銀屑病的治療中有顯著的療效。我們曾發(fā)現(xiàn)Hh信號通路在銀屑病皮損中處于過度激活狀態(tài)。
　　為進(jìn)一步確定cyclopamine治療銀屑病的機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)以銀屑病SCID小鼠模型、正

4、常人角質(zhì)形成細(xì)胞系（Hacat）為研究對象，觀察cyclopamine作用后Hacat細(xì)胞因子分泌表達(dá)的變化及移植皮片組織病理的變化。
　　本研究的主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下：
　　一．銀屑病SCID小鼠動物模型的構(gòu)建
　　切取銀屑病患者皮損移植給SCID小鼠，移植后10天，移植皮片周圍分點(diǎn)皮下注射經(jīng)刀豆蛋白A（ConcanavalinA，ConA）刺激的銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞（Peripheral blood mon

5、ouclear cells，PBMCs），細(xì)胞數(shù)約為4×106/鼠。移植后15天，絕大多數(shù)移植皮片外觀和組織病理學(xué)特征呈明顯的銀屑病改變。我們根據(jù)Baker評分法，對所有的移植模型進(jìn)行評分，結(jié)果為8.278±0.244（典型的銀屑病皮損評分在4.0-10.0之間）。因此從大體表現(xiàn)、組織病理方面，移植皮片均能保留銀屑病的表型特點(diǎn)，表明銀屑病SCID小鼠動物模型構(gòu)建成功。
　　二．Cyclopamine對銀屑病SCID小鼠模型的作用<

6、br>　　1.分組及給藥
　　將構(gòu)建好的動物模型隨機(jī)分為3組，每組4只，分別對應(yīng)以下處理：5mmol/mLcyclopamine治療組：cyclopamine加DMSO、生理鹽水稀釋，DMSO終濃度40％，均勻涂抹于移植皮片，每次給藥50μL，每天給藥兩次，連續(xù)給藥15天；5mmol/mLtomatidine對照組：以tomatidine取代cyclopamine，劑量、配制及外用方法同cyclopamine組；空白對照組：DMS

7、O、生理鹽水不加cyclopamine，用法同上。
　　2．結(jié)果
　　治療后15天比較各組治療效果：
　　移植皮片外觀顯示cyclopamine組治療后移植皮片紅斑、鱗屑消失，幾乎接近于正常皮膚，組織病理學(xué)顯示表皮顯著變薄、炎細(xì)胞浸潤減輕、組織學(xué)評分顯著降低；tomatidine對照組和空白對照組皮損保持明顯紅斑，可見白色鱗屑，同治療前相比無明顯改變，組織學(xué)顯示表皮厚度幾乎保持不變，盡管角化不全消失，部分顆粒層出現(xiàn)，但

8、仍見角化過度、棘層肥厚、表皮突延長、真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張充血及炎細(xì)胞浸潤等銀屑病改變。
　　本部分研究外用cyclopamine進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)其可明顯促進(jìn)SCID小鼠銀屑病樣皮損的恢復(fù)，具有良好的治療效果，為cyclopamine的銀屑病治療向臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為銀屑病的治療提供新的方向。
　　三．Cyclopamine處理后Hacat細(xì)胞因子分泌表達(dá)的變化
　　本部分實(shí)驗(yàn)采用ELISA和RT-PCR方法檢測Haca

9、t在cyclopamine處理后IL-6、8、TNF-α分泌表達(dá)的變化。結(jié)果顯示：
　　1．Hacat在cyclopamine處理12h、24h、48h后用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、8、TNF-α的分泌明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，尤以5μmol/mLcyclopamine組為著。
　　2．Hacat在cyclopamine處理12h、24h、48h后用RT-PCR方法檢測細(xì)胞中IL-8的mRNA表達(dá)明顯下降