脾臟樹突狀細胞在多器官功能障礙綜合征炎癥反應機制中作用的研究.pdf

1、目的： 1．研究MODS小鼠脾臟樹突狀細胞(DC)病變對多種炎癥因子變化的影響及其分子機制。 2．探討膽堿能抗炎通路對MODS早期DC及細胞免疫功能的影響與調節(jié)作用。 3．研究Flt3L對MODS免疫失衡的可能保護效應。 方法：腹腔注射酵母多糖復制小鼠MODS模型，實驗分組： (1)正常對照組(n=30)； (2)MODS組(n=150)又分為6小時、24小時、48小時、6日和10～12日

2、組； (3)卡巴膽堿治療組(n=30)：致傷前小鼠經(jīng)胃給予卡巴膽堿(3μg/kg，三次)； (4)Flt3L治療組(n=30)：在MODS病程緩解期腹腔注射Flt3L(5μg/kg/日，連續(xù)7天)。分別在設定的時間點采取血和肺、肝、腎、脾臟等組織標本。采用MiniMACS免疫磁性分離系統(tǒng)分離純化脾臟DC，運用流式細胞技術檢測脾臟DC免疫表型、外周血T細胞亞群和外周血單個核細胞MHC-Ⅱ類分子。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測DC孵育

3、上清及組織勻漿液的細胞因子，用熒光定量PCR檢測DC中NF-κBp65mRNA表達水平。免疫組化檢測脾臟中CD86、IL-1β、IL-10和HMGB1表達。光、電鏡觀察各組臟器結構改變。 結果： (1)IL-1β陽性細胞數(shù)量在傷后6、24小時組明顯升高，48小時至10～12日組降至正常水平。HMGB1陽性細胞數(shù)量在傷后6小時組開始升高，于48小時組達峰值；6日組降至正常，10～12日組再次明顯升高；IL-10陽性細胞數(shù)量

4、在傷后48小時組開始升高，10～12日組達峰值； (2)脾臟DC的含量在6和24小時組明顯增加，48小時組開始下降，6日組接近正常組，10～12日DC數(shù)量再次明顯增生；傷后6和124小時組DC表面分子MHC-Ⅱ和CD86的表達明顯增高，48小時和6日組MHC-Ⅱ和CD86下降至正常水平，10～12日組MHC-Ⅱ和CD86的表達明顯降低。DC孵育上清中IL-12p70含量在傷后6、24小時組明顯增加，48小時和6日組恢復至正常水平

5、，10～12日組IL-12p70含量明顯降低。傷后6、24小時組DC細胞中NF-κB p65mRNA的表達顯著增加，10～12日組NF-κBp65mRNA表達明顯下降。 (3)傷后6～48小時組，實驗鼠臟器功能指標中ALT升高，其余改變不明顯。外周血中單核細胞對MHC-Ⅱ分子表達及CD4<'+>T細胞數(shù)均減少，CD4/CD8比值下降。病理改變主要為部分臟器實質細胞變性伴間質淤血、水腫；6日組，實驗鼠功能與形態(tài)均有好轉。外周血單核

6、細胞MHC-Ⅱ分子表達及CD4<'+>T細胞數(shù)均有增加，CD4/CD8比值回升。10～12日組，各項生化指標均顯著上升，外周血單個核細胞MHC-Ⅱ分子表達降至最低點，CD4<'+>T細胞也明顯減少，CD4/CD8比值明顯下降。主要臟器實質細胞多呈變性與灶狀壞死改變。 (4)卡巴膽堿治療組脾臟DC對MHC-Ⅱ表達下降，脾臟中IL-12 p70水平下降；脾臟中IL-1β和HMGB1陽性細胞明顯下降；臟器功能與形態(tài)改變均較輕微。

7、 (5)體外實驗證實1μmol/ml、10μmol/ml和100μmol.ml濃度的卡巴膽堿均能夠降低LPS刺激的培養(yǎng)DC對MHC-Ⅱ的表達及其IL-12 p70的分泌。其中卡巴膽堿濃度在100μmol/ml時對DC表面MHC-Ⅱ表達和DC分泌IL-12p70的抑制作用最明顯。α-銀環(huán)蛇毒素可明顯阻斷卡巴膽堿的上述效應。 (6)Flt3L治療組脾臟DC對MHC-Ⅱ表達明顯增加，脾組織中IL-12p70水平明顯升高，外周血單個核

8、細胞MHC-Ⅱ分子表達增加，CD4<'+>T細胞數(shù)也明顯增多，CD4/CD8比值明顯上調。脾臟中IL-10陽性細胞數(shù)下降；肝、腎功能指標接近正常組，肺、肝、腎、心和脾臟病理改變較MODS12日組明顯減輕。 結論： 1．脾臟樹突狀細胞的活性變化與多種炎癥因子表達的變化在MODS病程中具有密切的相關性和規(guī)律性。 2．樹突狀細胞對MODS炎癥反應的方向具有影響和調節(jié)作用。NF-κB-IL-12途徑是樹突狀細胞免疫．炎癥