STAT3在CTGF調(diào)控人牙髓細(xì)胞分化中作用的研究.pdf

1、炎癥、外傷等造成的牙髓損傷逐年增多，而現(xiàn)有的臨床治療方法還不能完全再造牙髓或代替牙髓組織的功能。牙髓細(xì)胞(Human Dental PlupCells，hDPCs)是一種具有一定的自我增殖和分化潛力的細(xì)胞。以往研究已證實(shí)體外培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞有形成鈣化組織的能力，這種能力依賴于有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子的調(diào)控，即細(xì)胞因子能夠不同程度的刺激受損的牙髓細(xì)胞再生。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connective tissue growth factor，C

2、TGF)具有強(qiáng)烈促纖維化的作用，它可以增強(qiáng)牙髓細(xì)胞的礦化能力，但不能刺激牙髓細(xì)胞增殖，其中作用的分子機(jī)制尚不清楚。近年來發(fā)現(xiàn)酪氨酸蛋白激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus protein tyrosine kinase-Signal transducerand activator of transcription，JAK-STAT)通路與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化等相關(guān)。本研究即探討STAT3是否在CTGF刺激牙髓細(xì)胞增殖分化過程中起

3、重要作用。本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 CTGF在人牙髓細(xì)胞增殖、分化過程中的作用
　　目的:體外培養(yǎng)hDPCs，觀察CTGF對(duì)hDPCs增殖、分化的影響。
　　方法:選取由于正畸或阻生拔除的健康、完整的第三磨牙（均經(jīng)患者知情同意），在無菌條件下取出牙髓組織，采用組織酶消化法原代培養(yǎng)hDPCs并鑒定來源。采用不同濃度（0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）的CTGF作用于hDPC

4、s，作用不同時(shí)間后，通過甲基噻唑基四唑(MethylThiazolyl Tetrazolium，MTT)檢測(cè)CTGF對(duì)hDPCs增殖的影響;茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。
　　結(jié)果:
　　1.組織塊酶解法能成功培養(yǎng)出成纖維樣細(xì)胞，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)均一，為典型的梭形，胞體豐滿，胞漿豐富，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形位于細(xì)胞中央，核仁清晰可見。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果示波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性。
　　2.MTT結(jié)果顯

5、示CTGF三個(gè)濃度（10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）均對(duì)細(xì)胞無毒性作用，能促進(jìn)hDPCs增殖，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)作用效果增強(qiáng)，第1天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05），從第3天開始，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;茜素紅結(jié)果顯示CTGF組的礦化結(jié)節(jié)明顯高于對(duì)照組。
　　結(jié)論:組織塊酶解法能成功分離和培養(yǎng)出hDPCs;一定濃度的CTGF能夠促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖和分化。
　　第二部分 CTGF對(duì)人

6、牙髓細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)的影響
　　目的:觀察CTGF作用hDPCs后，細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)情況。
　　方法:取第四代hDPCs制成細(xì)胞懸液，爬片后隨機(jī)分為對(duì)照組、CTGF處理組、Stattic（STAT3特異性抑制劑）+CTGF處理組，分別培養(yǎng)30min后采用免疫組化SABC法檢測(cè)中STAT3活性蛋白（磷酸化蛋白，Phos-STAT3）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:hDPCs培養(yǎng)30 min后，CTGF處理組可見

7、棕色顆粒主要分布在細(xì)胞核中，即Phos-STAT3主要在細(xì)胞核中表達(dá);對(duì)照組相反，棕色顆粒主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，Phos-STAT3在胞質(zhì)中表達(dá)，細(xì)胞核中無表達(dá);Stattic+CTGF處理組細(xì)胞質(zhì)中棕色顆粒比對(duì)照組明顯減少，細(xì)胞核中無棕色顆粒，Phos-STAT3在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，但表達(dá)量比對(duì)照組降低。
　　結(jié)論:CTGF能明顯促進(jìn)STAT3磷酸蛋白的表達(dá)，并誘導(dǎo)Phos-STAT3轉(zhuǎn)移細(xì)胞核中表達(dá);Stattic能抑制STAT3蛋

8、白磷酸化。
　　第三部分 STAT3在CTGF誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化中的作用
　　目的:Stattic與CTGF聯(lián)合作用hDPCs后，觀察礦化結(jié)節(jié)以及ALP、OCN、OPN和DMP-1 mRNA表達(dá)水平。
　　方法:取第4代人牙髓細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以104個(gè)/ml的濃度接種在6孔板和50 ml培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞匯合后，將hDPCs隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組（20ng/ml的CTGF）和實(shí)驗(yàn)組（STAT3抑制劑Stattic作

9、用半小時(shí)后加入20ng/ml的CTGF），作用7d、14d、28 d后，采用茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成，Real-time PCR法檢ALP、OCN、OPN和DMP-1的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:茜素紅結(jié)果:與陽性對(duì)照組相比，加入Stattic后，礦化結(jié)節(jié)形成明顯減少。
　　PCR結(jié)果顯示:7天時(shí)，加入Stattic后，ALP、OCN、OPN和DMP-1的mRNA表達(dá)下降，CTGF組表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.

10、05）;14天時(shí)，加入Stattic后，ALP mRNA表達(dá)下降，CTGF組表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Stattic組與對(duì)照組OCN mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CTGF組的OCN mRNA表達(dá)增高，與其他兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Stattic組與對(duì)照組OPN mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CTGF組的OPN mRNA表達(dá)降低，較其他兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;DMP-1