人大腸癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)組分析與鑒定.pdf

1、惡性腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，但迄今為止，對腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究尚未獲得突破性進展。篩選和鑒定在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用的關(guān)鍵分子，尋找早期診斷的生物標志物和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物靶點，闡明腫瘤轉(zhuǎn)移機制，是當前腫瘤轉(zhuǎn)移的研究熱點。 腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多基因參與的復(fù)雜過程，腫瘤轉(zhuǎn)移的全過程受以下幾個因素的調(diào)控：1、在轉(zhuǎn)移啟動初期E-cadherin、Ig超家族、選擇素、整合素等參與腫瘤細胞間的脫落以及腫瘤細胞與胞外基質(zhì)的粘附

2、；2、腫瘤細胞或間質(zhì)細胞分泌的蛋白水解酶及其抑制劑，在降解胞外基質(zhì)和血管的基底膜過程中發(fā)揮重要作用；3、在運動因子、生長因子、歸巢因子等的作用下，腫瘤細胞遷移到轉(zhuǎn)移靶器官；4、血管增生因子VEGF、bFGF、IL-8、PDGF等促進新生血管的形成，伴隨著腫瘤細胞的增生，形成新的轉(zhuǎn)移灶，完成轉(zhuǎn)移過程。鑒于目前對腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究往往針對單個或少數(shù)幾個分子以及關(guān)注基因水平的改變，缺乏系統(tǒng)性和綜合性的分析，因此在所有這些調(diào)控因素中，究竟哪些分

3、子在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，仍有待闡明。近年來開展的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為揭示腫瘤轉(zhuǎn)移機制帶來了新的希望。 本研究以人大腸癌高、低轉(zhuǎn)移細胞株為研究對象，采用比較蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定了11個與大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的候選蛋白，并探討了HSP27在大腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及其功能，具體研究結(jié)果如下： 1、人大腸癌細胞系蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳技術(shù)的建立及其優(yōu)化 優(yōu)化人結(jié)腸癌Lovo細胞系的蛋白質(zhì)樣品制備方法，建立人結(jié)腸癌Lovo細胞系的雙向凝膠電

4、泳(2-DE)圖譜，為識別鑒定結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。分別用磷酸鹽緩沖液和等滲蔗糖溶液沖洗細胞，胰酶消化或直接刮刀法收集細胞后提取總蛋白質(zhì)，利用固相pH梯度雙向凝膠電泳技術(shù)進行分離，凝膠經(jīng)銀染顯色后，用PDQuest軟件分析2-DE圖譜。結(jié)果以等滲蔗糖緩沖液沖洗細胞并直接刮刀法所提取Lovo細胞總蛋白質(zhì)進行雙向電泳，可獲得分辨率高、重復(fù)性好的人結(jié)腸癌Lovo細胞系2-DE圖譜。等滲蔗糖溶液有效的降低了鹽離子對等電聚焦的影響，聚

5、焦效果優(yōu)于磷酸鹽緩沖溶液處理組；皿上直接刮刀收集的方法避免引入胰酶及其對細胞的破壞，保證了細胞蛋白質(zhì)的完整性和代表性。我們實驗表明以等滲蔗糖溶液沖洗細胞結(jié)合皿上直接裂解是一種較好的細胞蛋白質(zhì)雙向電泳樣品制備方法，在此基礎(chǔ)上我們初步建立了分辨率較高且重復(fù)性好的人結(jié)腸癌Lovo細胞系蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜。 2、人大腸癌細胞株SW480和SW620的蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳分析 為了更好的理解大腸癌轉(zhuǎn)移機理和尋找大腸癌預(yù)后的標志

6、分子，我們運用雙向凝膠電泳技術(shù)對人大腸癌高、低轉(zhuǎn)移細胞株SW480和SW620細胞進行了差異表達雙向凝膠電泳分析，數(shù)字化圖像分析發(fā)現(xiàn)有72個蛋白質(zhì)斑點在兩組凝膠中有顯著差異表達，在SW620細胞中表達量升高的蛋白質(zhì)斑點有30個，在SW480細胞中表達量升高的蛋白質(zhì)斑點有42個；定性差異表達分析(表達量相差10倍以上)發(fā)現(xiàn)22個蛋白質(zhì)斑點僅在SW620中出現(xiàn)，而有27個蛋白質(zhì)斑點只在SW480中檢測到，結(jié)合軟件分析和手工篩選，選取15個點

7、清晰且表達水平改變明顯的蛋白質(zhì)點作為質(zhì)譜鑒定的靶點。 3、雙向凝膠電泳差異表達蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定和驗證 以大腸癌高、低轉(zhuǎn)移細胞株為研究對象，采用2-DE分離技術(shù)結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定了11個與大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，其中SW620細胞株表達上調(diào)的蛋白質(zhì)有磷酸甘油酸變位酶1，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白和高遷移率族蛋白B-1，而熱休克蛋白27，膜聯(lián)蛋白I，甲硫腺苷磷酸化酶，切絲蛋白1和表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白在SW620中表達下調(diào)

8、。大多數(shù)差異蛋白功能涉及腫瘤細胞生長、運動、粘附、凋亡等過程，研究結(jié)果為闡明大腸癌轉(zhuǎn)移機制及尋找預(yù)測大腸癌轉(zhuǎn)移的潛在標志物提供了理論依據(jù)。 為保證蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定結(jié)果的可靠性，在蛋白和mRNA水平對候選蛋白進行了進一步驗證。采用westernblot和免疫細胞化學(xué)技術(shù)在蛋白質(zhì)水平驗證結(jié)果表明HSP27和COF1在低轉(zhuǎn)移的SW480中高表達，且COF1僅在SW480中檢測到，蛋白質(zhì)水平的驗證結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組的分析結(jié)果完全一致。此

9、外，采用半定量RT-PCR技術(shù)對編碼候選蛋白的mRNA水平檢測結(jié)果表明：編碼HMGB1和PBP的mRNA在高轉(zhuǎn)移的SW620中高表達，而編碼HSP27、ANXI、COF1和E-FABP的mRNA在SW480中高表達，所驗證的編碼候選蛋白的mRNA水平驗證結(jié)果與候選蛋白的蛋白質(zhì)組分析結(jié)果一致，說明候選蛋白在大腸癌細胞株中的蛋白水平變化主要是由于基因的轉(zhuǎn)錄水平高低不同所致，也肯定了候選蛋白在高、低轉(zhuǎn)移株間的差異表達。結(jié)果表明通過蛋白質(zhì)組技術(shù)

10、篩選到的轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白是可靠的。 4、熱休克蛋白27與大腸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析 為更好的理解大腸癌細胞的轉(zhuǎn)移機理和尋找可能的腫瘤預(yù)后標記分子標志物，我們用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對兩種不同轉(zhuǎn)移潛能的SW620和SW480細胞株的差異表達蛋白進行了研究，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白27在高轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞中的低表達。免疫細胞化學(xué)進一步驗證和分析了該蛋白在SW620和SW480兩種細胞中的差異表達和定位。68例臨床大腸癌組織標本的免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)

11、熱休克蛋白27的表達率與年齡、性別、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期無相關(guān)性(χ2test，p＞0.05)，但其過表達和大腸癌轉(zhuǎn)移顯著負相關(guān)(Fisher'sexacttest，p=0.035＜0.05)。結(jié)果表明，大腸癌細胞熱休克蛋白27的過表達和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移行為相關(guān)，可能在阻止其轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。 綜上所述，本研究應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組技術(shù)對人大腸癌SW620和SW480兩種不同轉(zhuǎn)移潛能細胞株進行了對比研究，獲得了11個差異