家蠶絲氨酸羧肽酶基因的克隆分析及其與卵黃蛋白的關(guān)系研究.pdf

1、羧肽酶是昆蟲體內(nèi)重要的消化酶系之一，而到目前為止，僅有少量關(guān)于昆蟲絲氨酸羧肽酶（seine carboxypeptidases，SCP）的描述，家蠶中未見相關(guān)研究報道。根據(jù)組織器官的差別，絲氨酸羧肽酶所發(fā)揮的功能存在差異，從消化食物乃至到合成神經(jīng)內(nèi)分泌肽等，都存在有絲氨酸羧肽酶的作用。本實驗基于家蠶SAGE文庫分析篩選出一個高溫與常溫表達差異顯著基因——絲氨酸羧肽酶基因，并從家蠶5齡幼蟲脂肪體中克隆了該基因，對該基因序列進行生物信息學(xué)分

2、析，調(diào)查了在常、高溫條件下，該基因在不同發(fā)育階段的表達規(guī)律，進一步分析該基因與卵黃蛋白的關(guān)系。獲得了以下研究結(jié)果：
　　1.家蠶絲氨酸羧肽酶（SCP）新基因cDNA的克隆及其分析
　　基于本研究室構(gòu)建的常、高溫條件下家蠶幼蟲組織 SAGE表達文庫，以雌性幼蟲高溫處理后顯著低表達 Tag(CATGGTGCCGCGGGACCAGCC)為線索，根據(jù)SAGE文庫中的注釋信息獲悉目的基因在家蠶基因組數(shù)據(jù)（http://www.silk

3、db.org/silkdb/）中的基因登錄號為BGIBMGA012773-TA，使用RACE技術(shù)，將其 mRNA序列由原來預(yù)測到的1416bp延長至1671bp，3’RACE延長了85bp，其中最長ORF1416 bp。通過構(gòu)建分子進化樹進一步分析，表明家蠶 BmSCP基因與大紅斑蝶的EHJ78980.1基因的進化距離最近，形成同一分支，與其他昆蟲的SCP在進化關(guān)系上相對較遠。通過家蠶SCP與脊椎動物以及其他物種中的SCP進行蛋白序列比

4、對分析發(fā)現(xiàn)，高等脊椎動物乃至昆蟲間SCP的氨基酸殘基具有較高保守性，存在較多的氨基酸相似位點，說明該蛋白在漫長的進化過程中保守性較高，并具有較高的種間相似性。5齡3d的幼蟲不同組織表達實驗與EST表達譜存在差異，BmSCP基因不僅在脂肪體中表達，而且還在多個組織中均有表達。通過分析初步鑒定該基因為家蠶中未報道過的絲氨酸羧肽酶基因(SCP)。
　　2.高溫處理對家蠶BmSCP基因的表達影響及特異性分析
　　分別提取5齡時期常溫

5、和高溫條件下不同性別不同發(fā)育期家蠶的脂肪體和中腸組織mRNA，通過熒光定量PCR的方法，調(diào)查在常溫和高溫處理條件下，不同性別不同組織中BmSCP基因的表達狀況。結(jié)果表明，在雌性家蠶5齡幼蟲脂肪體中，高溫組對比與常溫組之間，BmSCP基因表達有顯著差異，而在雄性中僅在5齡5d天時存在顯著差異；而在家蠶中腸組織中，與常溫組相比，雌性和雄性分別在5齡7d天和5齡3d天存在顯著差異。上述結(jié)果說明，BmSCP基因是一個高溫敏感基因，并且BmSCP

6、基因在雌性家蠶脂肪體中的敏感性明顯高于雌性中腸、雄性脂肪體和中腸中。
　　無論是常溫組還是高溫組，BmSCP基因在家蠶脂肪體的表達存在顯著性別差異，也就是說這種性別間差異表達規(guī)律與飼育溫度沒有直接關(guān)系。而在家蠶中腸中，BmSCP基因表達不存在明顯的性別差異。推測BmSCP基因在雌蠶脂肪體中存在一種特殊功能，可能與雌蠶生成卵內(nèi)所需的營養(yǎng)物質(zhì)儲存和轉(zhuǎn)化相關(guān)。
　　不同發(fā)育階段BmSCP基因組織差異表達分析顯示，在雌性家蠶中BmS

7、CP基因表達存在顯著組織差異，發(fā)現(xiàn)BmSCP基因在5齡期中腸中也存在高表達，進一步佐證了Peter等關(guān)于絲氨酸羧肽酶在昆蟲中腸中存在消化功能的推測，。
　　3.家蠶BmSCP基因與卵黃蛋白的關(guān)系
　　家蠶卵從開始成形到產(chǎn)下卵共8d，分析家蠶卵巢、卵中卵黃蛋白（Yolk protein，YP）含量與BmSCP基因的表達的關(guān)系，試驗結(jié)果顯示，YP的波動趨勢與BmSCP基因的表達趨勢相一致，推測SCP基因及其相應(yīng)的酶可能參與YP的