家蠶絲氨酸羧肽酶基因的克隆分析及其與卵黃蛋白的關(guān)系研究.pdf

1、羧肽酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的消化酶系之一，而到目前為止，僅有少量關(guān)于昆蟲(chóng)絲氨酸羧肽酶（seine carboxypeptidases，SCP）的描述，家蠶中未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。根據(jù)組織器官的差別，絲氨酸羧肽酶所發(fā)揮的功能存在差異，從消化食物乃至到合成神經(jīng)內(nèi)分泌肽等，都存在有絲氨酸羧肽酶的作用。本實(shí)驗(yàn)基于家蠶SAGE文庫(kù)分析篩選出一個(gè)高溫與常溫表達(dá)差異顯著基因——絲氨酸羧肽酶基因，并從家蠶5齡幼蟲(chóng)脂肪體中克隆了該基因，對(duì)該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分

2、析，調(diào)查了在常、高溫條件下，該基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律，進(jìn)一步分析該基因與卵黃蛋白的關(guān)系。獲得了以下研究結(jié)果：
　　1.家蠶絲氨酸羧肽酶（SCP）新基因cDNA的克隆及其分析
　　基于本研究室構(gòu)建的常、高溫條件下家蠶幼蟲(chóng)組織 SAGE表達(dá)文庫(kù)，以雌性幼蟲(chóng)高溫處理后顯著低表達(dá) Tag(CATGGTGCCGCGGGACCAGCC)為線索，根據(jù)SAGE文庫(kù)中的注釋信息獲悉目的基因在家蠶基因組數(shù)據(jù)（http://www.silk

3、db.org/silkdb/）中的基因登錄號(hào)為BGIBMGA012773-TA，使用RACE技術(shù)，將其 mRNA序列由原來(lái)預(yù)測(cè)到的1416bp延長(zhǎng)至1671bp，3’RACE延長(zhǎng)了85bp，其中最長(zhǎng)ORF1416 bp。通過(guò)構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)進(jìn)一步分析，表明家蠶 BmSCP基因與大紅斑蝶的EHJ78980.1基因的進(jìn)化距離最近，形成同一分支，與其他昆蟲(chóng)的SCP在進(jìn)化關(guān)系上相對(duì)較遠(yuǎn)。通過(guò)家蠶SCP與脊椎動(dòng)物以及其他物種中的SCP進(jìn)行蛋白序列比

4、對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，高等脊椎動(dòng)物乃至昆蟲(chóng)間SCP的氨基酸殘基具有較高保守性，存在較多的氨基酸相似位點(diǎn)，說(shuō)明該蛋白在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中保守性較高，并具有較高的種間相似性。5齡3d的幼蟲(chóng)不同組織表達(dá)實(shí)驗(yàn)與EST表達(dá)譜存在差異，BmSCP基因不僅在脂肪體中表達(dá)，而且還在多個(gè)組織中均有表達(dá)。通過(guò)分析初步鑒定該基因?yàn)榧倚Q中未報(bào)道過(guò)的絲氨酸羧肽酶基因(SCP)。
　　2.高溫處理對(duì)家蠶BmSCP基因的表達(dá)影響及特異性分析
　　分別提取5齡時(shí)期常溫

5、和高溫條件下不同性別不同發(fā)育期家蠶的脂肪體和中腸組織mRNA，通過(guò)熒光定量PCR的方法，調(diào)查在常溫和高溫處理?xiàng)l件下，不同性別不同組織中BmSCP基因的表達(dá)狀況。結(jié)果表明，在雌性家蠶5齡幼蟲(chóng)脂肪體中，高溫組對(duì)比與常溫組之間，BmSCP基因表達(dá)有顯著差異，而在雄性中僅在5齡5d天時(shí)存在顯著差異；而在家蠶中腸組織中，與常溫組相比，雌性和雄性分別在5齡7d天和5齡3d天存在顯著差異。上述結(jié)果說(shuō)明，BmSCP基因是一個(gè)高溫敏感基因，并且BmSCP

6、基因在雌性家蠶脂肪體中的敏感性明顯高于雌性中腸、雄性脂肪體和中腸中。
　　無(wú)論是常溫組還是高溫組，BmSCP基因在家蠶脂肪體的表達(dá)存在顯著性別差異，也就是說(shuō)這種性別間差異表達(dá)規(guī)律與飼育溫度沒(méi)有直接關(guān)系。而在家蠶中腸中，BmSCP基因表達(dá)不存在明顯的性別差異。推測(cè)BmSCP基因在雌蠶脂肪體中存在一種特殊功能，可能與雌蠶生成卵內(nèi)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)化相關(guān)。
　　不同發(fā)育階段BmSCP基因組織差異表達(dá)分析顯示，在雌性家蠶中BmS

7、CP基因表達(dá)存在顯著組織差異，發(fā)現(xiàn)BmSCP基因在5齡期中腸中也存在高表達(dá)，進(jìn)一步佐證了Peter等關(guān)于絲氨酸羧肽酶在昆蟲(chóng)中腸中存在消化功能的推測(cè)，。
　　3.家蠶BmSCP基因與卵黃蛋白的關(guān)系
　　家蠶卵從開(kāi)始成形到產(chǎn)下卵共8d，分析家蠶卵巢、卵中卵黃蛋白（Yolk protein，YP）含量與BmSCP基因的表達(dá)的關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果顯示，YP的波動(dòng)趨勢(shì)與BmSCP基因的表達(dá)趨勢(shì)相一致，推測(cè)SCP基因及其相應(yīng)的酶可能參與YP的