轉(zhuǎn)肽酶SrtA的表達純化與結(jié)晶及其抑制劑的篩選.pdf

1、被公認(rèn)為“超級細菌”的金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性菌，它廣泛地存在于人類的皮膚和粘膜表面。通常金黃色葡萄球菌感染可以用內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類或者喹諾酮類抗生素對其進行有效的治療。但是由于抗生素的濫用導(dǎo)致金黃色葡萄球菌產(chǎn)生了廣泛的耐藥性。抗生素危機已經(jīng)成為了全球性的挑戰(zhàn)，尋找結(jié)構(gòu)新穎的全新型抗生素的研究已經(jīng)迫在眉睫。
　　 具有毒力因子功能的細菌表面蛋白正在成為新的抗菌藥物研究的候選靶標(biāo)。研究思想是通過調(diào)控細菌表面蛋白與宿主的相互

2、作用，干擾細菌對宿主的入侵感染。SrtA酶是一種膜結(jié)合巰基轉(zhuǎn)肽酶，能識別表面蛋白C端所含的保守氨基酸基序LPXTG(X是指任意的氨基酸)，并裂解蘇氨酸(T)和甘氨酸(G)間的肽鍵，產(chǎn)生一個蘇氨酸的羰基末端，與細胞壁的五個甘氨酸交聯(lián)橋的氨基形成酰氨鍵，從而使表面蛋白被錨定到細胞壁的肽聚糖上。由于這種酶廣泛存在于很多重要的人類病原菌內(nèi)，如單核細胞增多型李氏桿菌、化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌等，基于轉(zhuǎn)肽酶的作用機制以及小分子抑制劑的研究，為解決針

3、對金黃色葡萄球菌甚至廣譜的細菌感染的化學(xué)治療難題必將提供有力的理論依據(jù)。
　　 SrtA酶由206個氨基酸組成，它的N端部分是一個跨膜區(qū)，C端部分則是一個催化區(qū)域。SrtA△N59在體外與SrtA的功能相同，能夠與底物L(fēng)PXTG發(fā)生轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，催化T和G之間的斷裂。根據(jù)已知SrtA的基因序列，我們設(shè)計了兩對SrtA△N59基因序列的引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增。其中一個PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamhI和SalI雙酶切后克

4、隆到載體pQE30中，另一個PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI and XhoI雙酶切后克隆到載體pET28b中。在大腸桿菌中表達重組蛋白SrtA△N59，并利用AKTA純化儀對其進行純化，得到了純度高于90％的SrtA△N59蛋白。將純化后的SrtA△N59蛋白濃縮為50mg/ml，采用懸滴法篩選晶體，在Grid試劑盒的D4和D5得到了SrtA的晶體。
　　 為了篩選SrtA酶的小分子抑制劑，我們利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，合成

5、SrtA酶的底物(O-aminobenzoyl-LPATG-diaminopropionic acid-dinitrophenyl-NH2，Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2)。當(dāng)?shù)孜镏蠰PATG沒有被SrtA酶切斷時，在一定波長的熒光的吸收很弱，但當(dāng)其被SrtA酶切斷后，則在此波長的熒光吸收將會大大增強。在篩選SrtA酶抑制劑的過程中，我們通過監(jiān)測酶抑制反應(yīng)后的熒光吸收值來判斷小分子化合物的活性。最后我們篩選出3個具有較強的