哮喘人氣道平滑肌細胞中蛋白激酶Cα對周期蛋白D1的影響及其對細胞增殖調控的研究.pdf

1、哮喘是一種以氣道高反應性，氣道炎癥和氣道重建為特征的慢性疾病，目前患病率顯著性增高，并且被認為是喪失勞動能力、醫(yī)療消費和可預防性死亡的主要原因之一。到目前為止許多研究機構已經證實：在慢性哮喘，氣道平滑肌在誘導氣道重建中起著主要作用。氣道平滑肌細胞的反常增殖導致了氣道重建和氣道高反應性，但是其具體的機制目前還不很清楚。 蛋白激酶C（PKC）是一絲氨酸-蘇氨酸激酶家族，它包括三種類型的異構體。傳統(tǒng)型(α,β1,β2和γ)可被鈣、佛波酯

2、和磷脂酰絲氨酸所激活；新型(δ,ε,η,θ，and μ)對鈣不敏感，但可被佛波酯和磷脂酰絲氨酸所激活；不典型型(ζandτ/λ)對鈣和佛波酯不敏感，但可被磷脂酰絲氨酸激活。人氣道平滑肌細胞表達PKCα,β1,β2,δ,ε,andζ。不同的異構體的體外激酶活性特征以及組織分布、亞細胞結構是有差別的。這些異構體參與信號通路，調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡、遷徙和粘附。許多研究者已經證明：PKC的激活是ASMCs增殖的必需事件，并且，不同的PKC異

3、構體在調節(jié)細胞增殖中起著不同的作用。在NIH3T3細胞，PKCε是一強有力的生長刺激因素，而PKCα和δ抑制生長。在A7r5血管平滑肌細胞，毛細血管內皮細胞和鼠結腸上皮細胞，PKCδ也抑制細胞周期進展。在血管平滑肌細胞，PKCδ的過度表達抑制G1期周期蛋白的表達，這與PKCδ控制周期蛋白D1的轉錄的假設一致。在人，牛和鼠氣道平滑肌細胞，PKCδ負性調節(jié)cyclinD1的轉錄。本實驗室已經證實：PKCα參與哮喘血清被動致敏的人氣道平滑肌細

4、胞增殖。 然而，PKCα調節(jié)的下游機制目前還不清楚。細胞周期進展是細胞增殖的的基本事件，目前已經有一些關于ASMCs中調節(jié)特殊細胞周期蛋白表達的信號轉導通路的研究。cyclinD（D1，D2和D3）是哺乳動物細胞G1期進展的關鍵調節(jié)蛋白，cyclinD1是許多生長刺激信號通路的靶基因。 那么，在哮喘人氣道平滑肌細胞，cyclinD1是否起關鍵作用？PKCα是否可通過調節(jié)cyclinD1表達來影響ASMC增殖?為此，本文利

5、用哮喘血清被動致敏的細胞模型來研究這些問題。 研究內容： 1. 用10％哮喘患者血清被動致敏人氣道平滑肌細胞（HASMCs）(B組)，以10％非哮喘者血清為對照(A組)。構建cyclinD1正、反義真核表達載體質粒并轉染干預 HASMC。用RT-PCR方法以及Western Blot方法檢測cyclinD1的mRNA及蛋白表達水平，用流式細胞術、四甲基偶氮唑鹽（MTT）法及增殖細胞核抗原（PCNA）免疫細胞化學技術檢測H

6、ASMC增殖。 2.生長融合、同步后的HASMCs用哮喘血清致敏后，分為對照組，PMA組和PMA＋Go6976組。干預24小時后，用3H－TdR摻入法和MTT法檢測細胞增殖；用碘化丙啶單染法流式細胞術分析細胞周期；用RT-PCR和western blotting檢測cyclinD1mRNA和蛋白的表達。進一步，還通過轉染重組的反義cyclinD1質粒(PCDNA3.1(+)/as-cyclinD1)來降低cyclinD1基因的表

7、達后，檢測PKCα對HASMCs增殖的影響。 3. 用10％哮喘患者血清被動致敏人氣道平滑肌細胞（HASMCs），予以PKC激活劑PMA刺激。分別以反義寡核苷酸(PKCα-asODN)和特異性阻斷劑U0126抑制PKCα和ERK的表達，用RT-PCR方法及Western Blot方法檢測干預前后cyclinD1和P21cip1的mRNA及蛋白表達水平，用流式細胞術和四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測HASMCs增殖。 4.

8、用10％哮喘患者血清被動致敏人氣道平滑肌細胞（HASMCs），予以PKC激活劑PMA刺激。分別以反義寡核苷酸(PKCα-asODN)和PDTC抑制PKCα表達和NF-κB活化。用凝膠電泳遷移率改變試驗（EMSA）檢測HASMCs中NF-κB的活性，用RT-PCR方法及Western Blot方法檢測干預前后cyclinD1的mRNA及蛋白表達水平，用流式細胞術和四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測HASMCs增殖。 結果： 1

9、.正常血清對照組細胞S期細胞比例、MTT吸光度值（A值）、PCNA表達陽率分別為(10.52±1.50)％、0.303±0.024和(39.4±8.53)％；哮喘血清組(B0組)細胞S期細胞比例、MTT吸光度值（A值）、PCNA表達陽率分別為（15.94±2.13）％、0.431±0.047和(53.2±7.5)％，均較對照血清組（A組）明顯增加(n=5,P<0.05)；轉染重組cyclinD1正義質粒組（B2組）細胞S期細胞比例、MT

10、T吸光度值（A值）、PCNA表達陽性分別為(26.10±2.16)％、0.591±0.042和（84.2±5.9）％，均較哮喘血清組（B0組）明顯增加(n=5,P<0.05)；而轉染反義質粒組(B3組)上述結果分別為（6.96±1.25）％、0.220±0.027和(29.8±8.2)％，均較哮喘血清組（B0組）明顯下降（n=5,P<0.05）。 2. PMA激活PKCα后上調cyclinD1表達和細胞增殖。而用Go6976特異

11、性抑制PKCα活性后，這種促cyclinD1表達和細胞增殖的作用顯著性下降。相反，PMA和Go6976對周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達無明顯影響。另外，轉染反義cyclinD1質粒后消除了PMA誘導的G1/S期進展和HASMCs增殖效應。 3. PMA刺激后磷酸化PKCα（p-PKCα）水平增高，ERK1/2，p-ERK1/2蛋白水平增高，cyclin D1、P21cip1表達明顯增強，HASMCs的增殖增強；而反義PK

12、Cα寡核苷酸轉入細胞抑制p-PKCα表達后，ERK1/2，p-ERK1/2表達明顯減弱，cyclin D1、P21cip1表達也明顯下降，HASMCs的增殖減弱(P<0.05,n=4)；用U0126抑制ERK1/2表達后，PMA刺激下p-PKCα水平仍然明顯增高，但cyclin D1、P21cip1的表達明顯下降，HASMCs的增殖減弱(P<0.05,n=4).。 4. PMA刺激后磷酸化PKCα(p-PKCα)水平增高，NF-

13、κB-DNA結合活性增強，cyclin D1表達明顯增強，HASMCs的增殖增強；而反義PKCα寡核苷酸轉入細胞特異性地抑制PΚCα表達后,p-PKCα水平下降，NF-κB-DNA結合活性明顯減弱，cyclin D1也明顯下降，HASMCs的增殖減弱(P<0.05,n=4)；用PDTC抑制NF-κB活性后，PMA刺激下p-PΚCα水平仍然明顯增高，但 cyclin D1的表達明顯下降，HASMCs的增殖減弱(P<0.05,n=4)。

14、 結論： 1. cyclinD1 促進哮喘血清被動致敏的HASMC的增殖。cyclinD1可能是哮喘HASMC增殖的重要調控蛋白。 2. PKCα可通過上調cyclinD1表達而促進哮喘血清被動致敏的人氣道平滑肌細胞增殖。 3. ERK1/2是PKCα的下游信號分子，PKCα-ERK1/2級聯參與了PMA所誘導的哮喘血清被動致敏的人氣道平滑細胞cyclin D1、P21cip1的表達上調及細胞增殖。

15、4. NF-κB是PKCα的下游信號分子，PΚCα-NF-κB級聯參與了PMA所誘導的哮喘血清被動致敏的人氣道平滑細胞cyclin D1的表達上調及細胞增殖。 綜上所述，上述結果表明：PKCα、cyclinD1參與了哮喘HASMC的增殖調控,并存在PKCα-ERK1/2-cyclinD1、PΚCα-NF-κβ-cyclinD1信號轉導途徑，從不同環(huán)節(jié)阻斷這一信號途徑對于針對性地抑制哮喘氣道平滑肌增殖、減輕氣道重建可能具有積極意義