小鼠近視動(dòng)物模型網(wǎng)膜PAX6基因啟動(dòng)子CpG島甲基化研究.pdf

1、目的:
　　1、研究C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視動(dòng)物模型視網(wǎng)膜PAX6基因mRNA水平的變化;
　　2、研究C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視動(dòng)物模型視網(wǎng)膜PAX6啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化水平的變化。
　　方法:
　　1建立C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視動(dòng)物模型:21日齡C57BL/6小鼠36只，隨機(jī)分為4組，單眼形覺剝奪組:剝奪4周(n=12)，對(duì)側(cè)眼作為自身對(duì)照;形覺剝奪恢復(fù)組(n=12):單眼形覺剝奪4

2、周，恢復(fù)7天;正常對(duì)照組(n=12)。實(shí)驗(yàn)前后分別用紅外偏心驗(yàn)光儀測(cè)量小鼠眼球的屈光狀態(tài)，光學(xué)相干斷層掃描儀測(cè)量眼球生物學(xué)參數(shù)，包括眼前節(jié)、玻璃體腔深度和眼軸長(zhǎng)度等。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用光學(xué)顯微鏡對(duì)各組的視網(wǎng)膜組織進(jìn)行取材，分別提取視網(wǎng)膜組織基因組RNA和DNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2 C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視視網(wǎng)膜PAX6mRNA水平的變化:取單眼形覺剝奪4周、單眼遮蓋4周，恢復(fù)7天以及年齡相匹配的正常對(duì)照組C57BL/6小鼠各

3、6只。分離視網(wǎng)膜組織，實(shí)驗(yàn)眼、對(duì)側(cè)眼、對(duì)照眼按隨機(jī)數(shù)字表，分別提取視網(wǎng)膜總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，realtime PCR檢測(cè)每組視網(wǎng)膜中PAX6的表達(dá)。在做檢測(cè)前考慮到視網(wǎng)膜不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)的差異性，用正常小鼠（另5周齡C57BL/6小鼠25只）檢測(cè)了不同時(shí)間點(diǎn)（8時(shí)、11時(shí)、14時(shí)、17時(shí)、20時(shí)五個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材各5只小鼠）視網(wǎng)膜PAX6的表達(dá)情況，確定了統(tǒng)一的取材時(shí)間消除時(shí)間的干擾因素。
　　3 C57BL/6小鼠形覺剝奪性近

4、視視網(wǎng)膜PAX6啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化水平的變化:取單眼形覺剝奪4周、單眼遮蓋4周，恢復(fù)7天以及年齡相匹配的正常對(duì)照組C57BL/6小鼠各6只。實(shí)驗(yàn)眼、對(duì)側(cè)眼、對(duì)照眼按隨機(jī)數(shù)字表，分別提取視網(wǎng)膜總DNA，亞硫酸鹽修飾后用克隆測(cè)序的方法檢測(cè)不同處理眼視網(wǎng)膜組織PAX6啟動(dòng)子區(qū)域Cp6島甲基化狀態(tài)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組內(nèi)實(shí)驗(yàn)眼對(duì)側(cè)眼比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，不同組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:<

5、br>　　1形覺剝奪4周后，同一小鼠的實(shí)驗(yàn)眼相比其對(duì)側(cè)眼及對(duì)照組對(duì)照眼均向近視方向漂移且P＜0.05。
　　2形覺剝奪4周，形覺剝奪眼和正常對(duì)照眼相比PAX6 mRNA下降58％(P＜0.05)，剝奪眼和對(duì)側(cè)眼相比PAX6 mRNA水平下降了52％(P＜0.05)。去除眼罩7天后，PAX6 mRNA表達(dá)完全恢復(fù)。
　　4形覺剝奪4周，形覺剝奪眼和正常對(duì)照眼PAX6啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化水平未見明顯差異，剝奪眼和對(duì)側(cè)眼之間甲

6、基化水平也沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1小鼠單眼形覺剝奪4周可誘導(dǎo)出相對(duì)明顯的近視;利用相干光斷層掃描儀測(cè)量小鼠眼球生物學(xué)參數(shù)可以較好反映屈光度的改變;
　　2 C57BL/6小鼠近視模型視網(wǎng)膜形覺剝奪眼和正常對(duì)照眼及對(duì)側(cè)眼相比PAX6mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。形覺剝奪恢復(fù)組實(shí)驗(yàn)眼PAX6 mRNA表達(dá)恢復(fù)至正常水平。
　　3 C57BL/6小鼠近視模型，視網(wǎng)膜PAX6 mRNA表達(dá)量的改變與該基因啟動(dòng)子