KLF4參與血管平滑肌細胞細胞骨架重構的分子機制研究.pdf

1、目的:細胞骨架是真核細胞中與保持細胞形態(tài)結構和細胞運動有關的纖維網(wǎng)絡,包括微管、微絲和中間絲。細胞骨架不僅在維持細胞形態(tài),承受外力、保持細胞內(nèi)部結構的有序性方面起重要作用,而且還參與許多重要的生命活動。Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor,GKLF/KLF4)是KLFs家族中與胚胎發(fā)育、細胞分化和癌癥發(fā)生密切相關的轉錄因子。作為真核生物轉錄因子,KLF4主要分布在細胞核,參與調(diào)控細胞增殖、分化、胚胎發(fā)育等重要的

2、生命過程,是體細胞重編程為誘導性多功能干細胞的重要誘導因子之一。目前對KLF4功能的研究往往局限在細胞核,關于KLF4在胞漿的分布及其功能尚鮮有報道。本文通過觀察KLF4與細胞骨架的相互作用,探討KLF4調(diào)節(jié)細胞骨架重構的分子機制。
　　 方法:用貼塊法分離、培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞,胰蛋白酶消化傳代,取2～5代細胞進行實驗。細胞免疫熒光染色和Western blot分析觀察KLF4在細胞不同部位的分布;免疫共沉淀檢查KLF4與h

3、hLIM之間的相互作用;激光共聚焦顯微鏡觀察KLF4與細胞骨架的相互作用;鬼比環(huán)肽染色分析細胞骨架的變化。
　　 結果:
　　 1、PDGF-BB促進KLF4核輸出
　　 細胞免疫熒光染色結果顯示,在靜止的VSMCs中,KLF4主要在胞核中分布。PDGF-BB刺激VSMCs60 min后,KLF4在胞質中的分布增加,刺激120 min后,KLF4在胞質中的分布進一步增加。Western blot結果顯示,隨著PD

4、GF-BB刺激VSMCs的時間的不斷延長,KLF4在胞質中的分布明顯增加,呈時間依賴性,提示PDGF-BB促進KLF4的核輸出。
　　 2、KLF4在胞質中與細胞骨架相互作用
　　 免疫雙熒光分析結果顯示,在靜止的VSMCs中,FITC標記的KLF4主要在胞核分布,與TRITC標記的α-actin無明顯的熒光重疊,說明KLF4不與actin相互作用。PDGF-BB刺激VSMCs60 min后,KLF4開始從胞核向胞質中轉

5、移,并與TRITC標記的α-actin熒光相互重合為黃色熒光。免疫共沉淀結果表明,PDGF-BB處理前,在VSMCs的胞質中,KLF4抗體不能與α-actin共沉淀,即沉淀物中沒有出現(xiàn)明顯的α-actin條帶,在給予PDGF-BB刺激后,沉淀物中出現(xiàn)清晰的α-actin條帶。提示,KLF4出核后在胞質中以與α-actin相互締合的方式存在。
　　 3、KLF4參與細胞骨架重構
　　 Western blot結果顯示,用細

6、胞骨架聚合劑(JPK)處理VSMCs后,KLF4在胞質中的分布明顯增加;細胞松弛素(CB),使KLF4在胞質中的分布明顯減少,提示,細胞骨架的重構影響KLF4的亞細胞定位。
　　 用GFP-KLF4融合蛋白表達載體轉染NIH3T3細胞后,給予PDGF-BB、CB、佛波酯(PMA)、JPK刺激,觀察其對細胞骨架重構的影響。免疫熒光分析結果顯示,靜止期的NIH3T3細胞中含有大量平行束狀分布的應力纖維。用PDGF-BB處理細胞后,束

7、狀分布的應力纖維變少,肌絲排列為網(wǎng)狀結構;CB使細胞中的應力纖維消失,微絲解聚,呈彌散狀分布于胞質中。PMA使細胞中的應力纖維形成podosome小體。JPK使細胞應力纖維變的更加粗大。與未轉染組相比,KLF4轉染的細胞中,經(jīng)PDGF-BB處理后,細胞束狀分布的應力纖維無明顯減少,肌絲仍呈束狀排列;KLF4轉染后再經(jīng)CB處理時,應力纖維雖然也有解聚,但仍可見部分束狀排列的纖維,說明KLF4對細胞骨架的解聚具有一定的抵抗作用;KLF4轉染

8、后再經(jīng)JPK處理時,細胞的應力纖維與未轉染組相比變的更加粗大;KLF4轉染后再經(jīng)PMA處理,podosome小體形成明顯減少,這些結果提示,KLF4參與了細胞骨架的重構。
　　 4、KLF4通過與hhLIM相互作用促進PDGF-BB介導的細胞骨架重構
　　 上述研究結果顯示,PDGF-BB可以促進KLF4與actin相互作用,但KLF4無典型的actin結合結構域,那么KLF4是否通過與actin結合蛋白hhLIM相互作

9、用參與細胞骨架重構呢?為明確KLF4是否與hhLIM相互作用,我們檢測KLF4與hhLIM是否能夠免疫共沉淀。免疫共沉淀分析結果顯示,PDGF-BB促進KLF4與hhLIM相互作用。上述結果說明,KLF4通過hhLIM與細胞骨架相互作用并調(diào)節(jié)細胞骨架的重構。
　　 結論:
　　 1、PDGF-BB誘導KLF4出核,且KLF4在胞質中與細胞骨架相互作用。
　　 2、KLF4參與細胞骨架的重構。
　　 3、K