1-磷酸鞘氨醇抑制C2-神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)小鼠早期胚胎凋亡的作用機(jī)制.pdf

1、[研究背景]
　　 細(xì)胞凋亡參與卵母細(xì)胞受精障礙、胚胎發(fā)育停滯，從而導(dǎo)致體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)失敗。因而，抗凋亡干預(yù)胚胎發(fā)育過程可能成為改善胚胎發(fā)育潛能、提高胚胎質(zhì)量和IVF-ET成功率的潛在途徑。研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人類植入前胚胎中大約有75％的胚胎存在不同程度的細(xì)胞內(nèi)碎片和不對稱性，其中大約50％的胚胎在第一周內(nèi)停止發(fā)育。然而導(dǎo)致

2、胚胎丟失的原因尚不清楚，可能包括染色體異常，培養(yǎng)條件欠佳或卵母細(xì)胞成熟障礙。也有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)育停滯的胚胎及碎片多的胚胎中細(xì)胞凋亡發(fā)生比率增高。因而，本研究通過在胚胎體外培養(yǎng)基中添加抗凋亡因子以期降低細(xì)胞凋亡程度、提高胚胎質(zhì)量。
　　 鞘脂類是細(xì)胞膜上普遍存在的一種成分，其代謝產(chǎn)物1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)既可通過胞外受體途徑又可作為胞內(nèi)第二信使發(fā)揮著重要的生理學(xué)功能，如調(diào)控細(xì)胞存活、生

3、長、增殖和凋亡。S1P不但可以抑制輻射、熱刺激等誘發(fā)的卵巢、卵母細(xì)胞以及男性生殖發(fā)生細(xì)胞凋亡，而且外源性S1P可減少早期胚胎細(xì)胞凋亡從而改善胚胎發(fā)育潛能。大部分鞘脂代謝產(chǎn)物是具有生物活性的，其中神經(jīng)酰胺(ceramide，Cer)和鞘氨醇(sphingosine，Sph)是細(xì)胞凋亡的激活因子，而1-磷酸鞘氨醇(S1P)能夠促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，應(yīng)激因子激活鞘磷脂酶產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;存活因子激活鞘氨醇激酶1(sphingosine

4、 kinase，SphK1)致S1P增加而抑制Cer誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。細(xì)胞內(nèi)S1P和Cer間的動態(tài)平衡構(gòu)成了“鞘磷脂變阻器(sphingolipidrheostat)”，因S1P和Cer發(fā)揮相反的生物學(xué)效應(yīng)，且在細(xì)胞內(nèi)可相互轉(zhuǎn)化，S1P/Cer的比值變化可導(dǎo)致“sphingolipid rheostat”失衡，而S1P和Cer間的動態(tài)平衡是決定細(xì)胞命運(yùn)的重要因素。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，25nMS1P可提高體外培養(yǎng)小鼠早期胚胎的囊胚形成率

5、并降低2-4細(xì)胞期胚胎阻滯率和有碎片的胚胎率，而50μM C2-神經(jīng)酰胺(C2-ceramide，CED)即可顯著降低體外培養(yǎng)小鼠胚胎的囊胚形成率并使得2-4細(xì)胞期阻滯胚胎率和有碎片的胚胎率增加（與空白對照組比較）。因此，本研究通過在體外胚胎培養(yǎng)基添加25nMS1P和50μM CED，追蹤觀察小鼠胚胎體外發(fā)育情況，采用TUNEL、CASPASE原位熒光細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)檢測小鼠早期胚胎細(xì)胞凋亡情況，探討S1P能否抑制CED誘導(dǎo)的胚胎細(xì)胞凋

6、亡、提高胚胎發(fā)育潛能。
　　 全基因表達(dá)譜芯片技術(shù)作為基因組學(xué)研究的工具，可同時監(jiān)測大量基因在胚胎不同發(fā)育時期的表達(dá)變化，從而成為研究發(fā)育相關(guān)基因的有效工具。利用芯片技術(shù)已經(jīng)對小鼠植入前胚胎發(fā)育、小鼠小腦發(fā)育等過程基因表達(dá)進(jìn)行了研究。故本研究采用全基因表達(dá)譜芯片技術(shù)分別分析CED、CED和S1P同時處理后小鼠早期胚胎中基因表達(dá)譜變化情況，分析參與CED促進(jìn)胚胎細(xì)胞凋亡和S1P抑制胚胎細(xì)胞凋亡過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及參與凋亡通路的相

7、關(guān)基因。
　　 腫瘤抑制基因p53調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡等細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)過程。p53基因也能夠通過誘導(dǎo)不同促凋亡基因表達(dá)激活死亡受體和線粒體凋亡通路。早期研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤應(yīng)激反應(yīng)中，p53作為神經(jīng)酰胺作用的下游靶點(diǎn)。而且在神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的SKN-SH細(xì)胞凋亡過程中發(fā)現(xiàn)p53調(diào)控Bcl-2/Bax比例和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease，caspase

8、)表達(dá)/激活比例。因此，本研究中采用熒光定量PCR技術(shù)檢測凋亡基因p53在小鼠早期胚胎中的表達(dá)情況，探討S1P抑制早期胚胎凋亡的可能機(jī)制，為S1P抗凋亡干預(yù)改善胚胎發(fā)育技術(shù)應(yīng)用于體外受精-胚胎移植臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分1-磷酸鞘氨醇、C2-神經(jīng)酰胺對小鼠兩細(xì)胞期胚胎基因表達(dá)譜的影響
　　 [目的]
　　 通過分析C2-神經(jīng)酰胺(CED)、C2-神經(jīng)酰胺和1-磷酸鞘氨醇(S1P)同時處理后小鼠兩細(xì)胞

9、期胚胎中全基因表達(dá)譜變化，了解其中差異性表達(dá)基因情況，探討參與S1P抑制胚胎細(xì)胞凋亡、CED誘導(dǎo)胚胎凋亡過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及參與凋亡通路的相關(guān)基因。
　　 [方法]
　　 1.將體內(nèi)受精體外培養(yǎng)獲得的受精卵隨機(jī)分為四組:空白對照組，CED組，CED+甲醇組，CED+S1P組，體外培養(yǎng)24h。
　　 2.分別提取上述四組中小鼠兩細(xì)胞期胚胎的Total RNA，采用小鼠全基因表達(dá)譜芯片（Affymetrix Gen

10、eChip(@)Mouse Genome4302.0 Array）進(jìn)行微陣列實(shí)驗(yàn)。Affymetrix GeneChip(@)芯片有4500個探針，可檢測約34000個已確定的小鼠基因。
　　 3.通過GeneChip(@)操作系統(tǒng)獲得每個基因表達(dá)值，并通過各組間的比較決定基因表達(dá)信號值差異。差異性表達(dá)基因定義為基因表達(dá)變化大于2倍。采用Cluster3.0對所有芯片基因進(jìn)行聚類分析，并將檢測到的差異性表達(dá)基因輸入生物學(xué)數(shù)據(jù)庫G

11、ene Ontology(GO)和KEGG進(jìn)行GO分析和Pathway功能分析。
　　 [結(jié)果]
　　 1.應(yīng)用Cluster3.0軟件進(jìn)行聚類分析，比較空白對照組與CED組、CED組+甲醇組及CED+S1P組小鼠兩細(xì)胞期胚胎中基因表達(dá)譜變化。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，CED、CED+甲醇及CED+S1P處理后兩細(xì)胞期小鼠胚胎的基因表達(dá)譜發(fā)生變化，且其表達(dá)譜變化趨勢相似。
　　 2.使用SAM軟件對微陣列實(shí)驗(yàn)結(jié)

12、果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和分析。將CED組、CED+甲醇組與空白對照組的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)差異性表達(dá)基因1466個，上調(diào)408個，下調(diào)1058個。其中與細(xì)胞凋亡相關(guān)差異性表達(dá)基因63個，上調(diào)29個，下調(diào)34個;其中包括抗凋亡基因12個，6個上調(diào)，6個下調(diào)。將差異性表達(dá)基因輸入KEGG通路進(jìn)行Pathway分析，結(jié)果顯示差異性表達(dá)基因參與的凋亡相關(guān)信號通路包括促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase

13、，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞周期、p53信號通路、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 3.將CED+S1P組與CED組、CED+甲醇組的基因表達(dá)譜比較，發(fā)現(xiàn)差異性表達(dá)基因51個，上調(diào)26個，下調(diào)25個。其中與細(xì)胞增殖相關(guān)基因3個:Cdkn1b、Fgfr2（上調(diào)），Scarb1（下調(diào)）;與細(xì)胞分化相關(guān)基因1個:Nav1（下調(diào)）;與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因一個3個:Tgm2（上調(diào)），Traf3、Atm下調(diào)。Pathway分析差異性表達(dá)

14、基因參與的凋亡相關(guān)通路包括細(xì)胞周期、p53信號通路、細(xì)胞凋亡及MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。上述通路包含差異性表達(dá)基因Cdkn1b、Atm、Fgfr2，其中Cdkn1b、Fgfr2上調(diào)，Atm下調(diào)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.CED、S1P處理后小鼠基因表達(dá)譜發(fā)生改變，且CED組、CED+甲醇組、CED+S1P組小鼠基因表達(dá)譜變化趨勢相似。
　　 2.CED影響小鼠兩細(xì)胞胚胎中凋亡相關(guān)基因、抗凋亡基因及凋亡通路相關(guān)基因表

15、達(dá)變化，既有上調(diào)又有下調(diào)。
　　 3.S1P可能通過上調(diào)基因Cdkn1b、Fgfr2促進(jìn)胚胎細(xì)胞增殖、下調(diào)基因Atm抑制胚胎細(xì)胞凋亡。且S1P可能通過細(xì)胞周期、p53信號通路、細(xì)胞凋亡及MAPK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制小鼠胚胎凋亡。
　　 第二部分1-磷酸鞘氨醇、C2-神經(jīng)酰胺在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的作用
　　 [目的]
　　 通過分析抗凋亡因子1-磷酸鞘氨醇(S1P)和和促凋亡因子C2-神經(jīng)酰胺(CED)對

16、小鼠早期胚胎發(fā)育的影響，探討S1P子在抑制早期胚胎凋亡和促進(jìn)早期胚胎發(fā)育中的可能作用機(jī)制，了解細(xì)胞凋亡調(diào)控基因p53在早期胚胎發(fā)育中所起作用。
　　 [方法]
　　 1.將小鼠胚胎體外培養(yǎng)至囊胚期，跟蹤觀察胚胎細(xì)胞數(shù)目變化及形態(tài)變化，計(jì)算囊胚形成率及細(xì)胞凋亡數(shù)目。
　　 2.采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(Terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated

17、 dUTP nick-end labeling, TUNEL)檢測和Caspase原位熒光凋亡檢測技術(shù)分析小鼠早期胚胎的細(xì)胞凋亡情況。
　　 3.采用熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測小鼠早期胚胎發(fā)育過程中凋亡基因p53表達(dá)水平。
　　 4.實(shí)驗(yàn)分組:空白對照組，CED組，CED+甲醇組，CED+S1P組。
　　 [結(jié)果]
　　 1.空白對照組中有81.3％、CED+S1P組中65.3％的胚

18、胎發(fā)育至囊胚期，而CED組和CED+甲醇組中分別有24.1％、27.9％的胚胎發(fā)育至囊胚期(P＜0.01)。體外培養(yǎng)的胚胎中，與空白對組及CED+S1P組比較，CED組中66.34％、CED+甲醇組61.33％的胚胎在桑椹胚期發(fā)育停滯(P＜0.05)。
　　 2.CED組和CED+甲醇組的Caspase綠色熒光信號高于空白對照組和CED+S1P組。TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)CED組及CED+甲醇組中細(xì)胞凋亡信號顯著多于CED+S1P組及

19、空白對照組。
　　 3.CED組（9.3±0.7）和CED+甲醇組（8.7±0.5）的囊胚凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對照組（1.3±0.3）和CED+S1P組(3.2±0.6)(P＜0.05)。CED組（81.3±5.1，n=26）、CED+甲醇組（83.9±5.4，n=26）、空白對照組（89.3±4.5，n=27）與CED+S1P組（(84.1±5.2， n=26)四組間的胚胎細(xì)胞總數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4.熒光定量P

20、CR(Real-time PCR)檢測CED組和CED+甲醇組p53 mRNA表達(dá)水平較空白對照組和CED+S1P組顯著增高(P＜0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.CED可顯著降低小鼠胚胎囊胚形成率，增加桑椹胚期p53基因表達(dá)水平，增加囊胚期分裂球細(xì)胞凋亡。
　　 2.S1P可部分抑制CED對小鼠早期胚胎發(fā)育的影響，提高小鼠胚胎囊胚形成率，減少囊胚期分裂球細(xì)胞凋亡，降低桑椹胚期p53基因表達(dá)水平。