神經(jīng)酰胺參與硬脂酰輔酶A去飽和酶-1抑制腸癌細(xì)胞凋亡的過程.pdf

1、結(jié)直腸癌屬于一種發(fā)病率高且死亡率高的惡性消化道腫瘤，它在發(fā)病初期的癥狀并不明顯，導(dǎo)致患者確診時多為晚期癌癥。結(jié)直腸癌在術(shù)后容易復(fù)發(fā)并且對放療和化療的敏感性較差，因此尋找結(jié)直腸癌的有效臨床檢測指標(biāo)以及潛在的有效治療靶標(biāo)顯得尤為重要。
　　硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(SCD1)是調(diào)節(jié)脂肪酸不飽和度的關(guān)鍵限速酶，它為腫瘤增殖所必需的膜磷脂等提供了重要的成分來源。目前已有的研究證明SCD1在一些常見腫瘤組織中的基因表達(dá)及蛋白水平均高于正常組

2、，它與腫瘤的惡化進(jìn)程呈一定的正相關(guān)關(guān)系。SCD1的表達(dá)水平有可能成為腫瘤診斷及預(yù)后的重要生物標(biāo)志物之一。抑制SCD1后發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)增殖受阻以及凋亡的現(xiàn)象，這進(jìn)一步說明SCD1是腫瘤發(fā)展過程中必不可少的代謝酶。此外，作為生物脂類的重要組成之一，神經(jīng)酰胺在誘導(dǎo)腫瘤凋亡的研究報道也越來越多。作為生物體內(nèi)脂類調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要成員，關(guān)于SCD1和神經(jīng)酰胺在調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡上的關(guān)聯(lián)性研究顯得更為重要。SCD1抑制后是否依賴神經(jīng)酰胺從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞

3、的凋亡？針對這一疑問，本文提出假設(shè):在小分子抑制劑抑制SCD1的活性后，結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的從頭合成能力增強(qiáng)從而提高神經(jīng)酰胺的含量，進(jìn)而誘發(fā)線粒體功能紊亂，最終導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。為了驗證這一設(shè)想，論文的實驗內(nèi)容分為以下幾部分:
　　一、結(jié)直腸癌組織樣本中SCD1表達(dá)水平及神經(jīng)酰胺含量水平檢測
　　收集45例結(jié)直腸癌患者的腫瘤樣本以及癌旁正常樣本，分別用Real-timePCR以及Western blot方法檢測SCD1的

4、基因水平及蛋白表達(dá)水平，利用液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)檢測長鏈神經(jīng)酰胺的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌樣本中SCD1的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，并且腫瘤組織中C16∶0、C24∶0、C24∶1神經(jīng)酰胺的含量明顯增高，而C18∶0與C20∶0神經(jīng)酰胺的含量則偏低。
　　二、SCD1抑制劑對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響
　　檢測Colo205、LOVO、HCT15、LS1034、LS180、HCT116、HT29等7種腸癌細(xì)胞系中S

5、CD1的基因水平及蛋白表達(dá)水平。給予不同濃度的SCD1小分子抑制劑A939572后，利用CCK8法檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖情況。發(fā)現(xiàn)SCD1抑制劑可以普遍抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，且抑制效果呈濃度梯度依賴。
　　三、SCD1抑制劑提高結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的從頭合成產(chǎn)量
　　選取對SCD1抑制劑較為敏感的LOVO及Colo205細(xì)胞作為實驗對象，同時或分別給予兩種不同結(jié)構(gòu)類別的SCD1抑制劑A939572/Cay10566和神經(jīng)

6、酰胺從頭合成酶抑制劑L-cycloserine后，使用CCK8法檢測腸癌細(xì)胞的增殖情況，利用流式細(xì)胞術(shù)對腫瘤細(xì)胞的凋亡狀態(tài)進(jìn)行檢測，使用Wester blot法檢測凋亡蛋白的表達(dá)水平，采用液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)檢測脂肪酸不飽和度以及神經(jīng)酰胺水平的變化。結(jié)果顯示抑制SCD1促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的從頭合成，提高長鏈神經(jīng)酰胺的表達(dá)水平從而促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。
　　四、SCD1抑制通過促進(jìn)長鏈神經(jīng)酰胺的從頭合成誘導(dǎo)線粒體功能

7、紊亂
　　同時或分別給予SCD1抑制劑A939572和神經(jīng)酰胺從頭合成酶抑制劑L-cycloserine后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞中的活性氧含量及線粒體的膜電位變化，采用Western blot法檢測線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放情況。實驗結(jié)果顯示在SCD1活性被抑制后，腫瘤細(xì)胞通過提高神經(jīng)酰胺的從頭合成能力，升高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，進(jìn)而改變線粒體膜電位，促使線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放到胞漿內(nèi)，最終誘發(fā)了線粒體功能的紊亂。