抑制JAK3激酶的活化對(duì)H5N1病毒HA蛋白介導(dǎo)的小鼠外周免疫器官損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的：人高致病性禽流行性感冒，簡稱人禽流感（human-avian influenza）是由禽甲型流感病毒中某些亞型毒株突破種屬感染人而引起人類的一種急性呼吸道傳染病。禽流感病毒H5N1除導(dǎo)致急性肺損傷外，還引起免疫系統(tǒng)損害。大量研究已經(jīng)表明：病毒介導(dǎo)了宿主病理性免疫應(yīng)答，引起急性免疫損傷是導(dǎo)致嚴(yán)重的急性呼吸綜合癥、呼吸衰竭以及免疫系統(tǒng)功能障礙的主要原因。研究還提示：抗病毒藥聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)制劑可能是防治急性免疫損傷且有效抗病毒感染的新策略

2、。實(shí)驗(yàn)室在SARS的發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV表面的Spike蛋白可以激活JAK-STAT信號(hào)通路，介導(dǎo)免疫損傷，JAK3（Janus kinase3）是關(guān)鍵信號(hào)靶分子。選擇性JAK3抑制劑能對(duì)抗SARS的免疫損傷作用，提高感染SARS小鼠的生存率，并對(duì)免疫細(xì)胞具有保護(hù)作用?；赟ARS和人禽流感病毒感染介導(dǎo)的臨床病理生理過程有諸多共同之處，推測禽流感病毒通過其表面膜蛋白HA，可能激活了共同的信號(hào)分子靶標(biāo)，引起急性免疫損傷。

3、為了證實(shí)這一問題，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，采納JAK3基因敲除小鼠研究了抑制JAK3激酶的活化對(duì)H5N1病毒HA蛋白介導(dǎo)的免疫損傷的保護(hù)作用，旨在于尋找一種能夠特異性靶向病毒介導(dǎo)的免疫損傷，并對(duì)免疫系統(tǒng)同時(shí)具有保護(hù)作用的小分子抗炎制劑，為人禽流感H5N1的免疫損傷治療提供新的策略。 研究內(nèi)容和方法： 一.氣道內(nèi)滴注H5N1病毒HA蛋白對(duì)JAK3基因敲除和對(duì)JAK3基因野生型對(duì)照小鼠外周免疫器官的影響 1.各16

4、只6-8周雄性JAK3基因敲除小鼠B6129S4-JAK3tmlLjb（JAK3-/-）和JAK3基因陽性對(duì)照鼠B6129SF2/J（JAK3+/+），各隨機(jī)分為PBS空白對(duì)照組、HA蛋白組，經(jīng)氣管內(nèi)滴注給予。 2.72小時(shí)后處死小鼠，分離肺和脾臟，并予以常規(guī)組織固定、包埋和切片，進(jìn)行HE染色、免疫組化觀察IP-10的表達(dá)。 二、氣道內(nèi)滴注H5N1病毒HA蛋白對(duì)脾細(xì)胞的免疫損傷在JAK3基因敲除和JAK3基因野生型對(duì)照小

5、鼠的不同影響 各16只6-8周雄性JAK3-/-小鼠和JAK3+/+小鼠，隨機(jī)分為PBS空白對(duì)照組、HA蛋白組，經(jīng)氣管內(nèi)滴注給予，72小時(shí)后處死小鼠，分離脾臟。 1. JAK3-/-小鼠（PBS處理）、JAK3-/-小鼠（HA處理）、JAK3+/+小鼠（PBS處理）和JAK3+/+小鼠（HA處理）各組小鼠分別分離脾臟細(xì)胞，各分為LPS（－）組、LPS刺激12H組、LPS（Lipopolysaccharide）刺激24小時(shí)

6、組，每組各種處理因素3復(fù)孔。CCK-8法檢測脾細(xì)胞LPS刺激后的損傷指數(shù)。 2.檢測各組小鼠脾細(xì)胞L2S刺激24小時(shí)后分泌Eotaxin、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL10、IL-13、IP-10、MIP-1a、MCP-1、Rantes等細(xì)胞因子和趨化因子的水平。 結(jié)果： 一、第一部分 1.JAK3+/+小鼠氣道內(nèi)滴注HA后可見顯著呼吸急促，活動(dòng)明顯減少，癥狀持續(xù)時(shí)間長。相比之下，JAK3-/-小鼠

7、HA處理后上述臨床癥狀較輕且消失早。 2.HA處理的JAK3+/+小鼠肺與脾組織病理表現(xiàn)為局部性彌漫性肺泡損傷，單核細(xì)胞侵潤，脾臟腫脹，毛細(xì)血管充血，生發(fā)中心局部結(jié)構(gòu)破壞，有空泡樣改變，淋巴細(xì)胞減少，見較多大單核吞噬細(xì)胞。HA處理的JAK3-/-小鼠肺及脾組織的損傷明顯減輕。脾臟結(jié)構(gòu)未見明顯異常。 3、HA處理的JAK3+/+小鼠較之JAK3-/-小鼠脾臟淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)廣泛IP-10陽染。 二、第二部分 1

8、.JAK3+/+小鼠與JAK3-/-小鼠HA預(yù)處理后脾細(xì)胞對(duì)LPS刺激的損傷指數(shù)高于PBS組，JAK3-/-HA預(yù)處理組小鼠對(duì)LPS反應(yīng)的損傷指數(shù)明顯低于JAK3+/+HA組小鼠。 2.JAK3+/+HA預(yù)處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞在無LPS刺激的基態(tài)下，IP-10、MCP-1a、Rantes的值明顯高于JAK3+/+PBS對(duì)照組；HA預(yù)處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞LPS刺激24小時(shí)較PBS預(yù)處理LPS刺激組顯著提高了IFN-γ、IP-10、

9、MCP-1a、Rantes的釋放水平。 3、JAK3-/-HA預(yù)處理小鼠脾細(xì)胞無LPS刺激基態(tài)下釋放IP-10、MCP-1a、Rantes的水平明顯低于JAK3+/+HA預(yù)處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞基態(tài)的釋放水平。JAK3-/-HA預(yù)處理組LPS刺激24h后，IFN-γ、IP-10、MCP-1a、Rantes的分泌量亦顯著低于JAK3+/+HA預(yù)處理組LPS刺激下的釋放水平。 結(jié)論： 1.氣道給于H5N1 HA表面膜蛋

10、白能夠始動(dòng)異常的免疫應(yīng)答，引起急性肺損傷和外周淋巴器官與免疫細(xì)胞破壞。JAK3-/-小鼠能夠耐受HA介導(dǎo)的免疫損傷，減小脾臟細(xì)胞重要的早期趨化因子IP-10的誘導(dǎo)。 2.JAK3-/-小鼠對(duì)HA介導(dǎo)的免疫損傷效應(yīng)具有保護(hù)作用；顯著減輕了繼而的LPS刺激導(dǎo)致的脾細(xì)胞損壞。JAK3-/-小鼠脾細(xì)胞對(duì)HA介導(dǎo)的免疫損傷呈現(xiàn)耐受，以及嗣后對(duì)LPS刺激的低反應(yīng)性是其具有顯著下調(diào)免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)的趨化因子的生成釋放的結(jié)果。 3.抑制