腎淋巴循環(huán)障礙對大鼠腎臟損害的機制研究及sirt3對腎臟的作用研究.pdf

1、淋巴循環(huán)(lymph ciruclation)是循環(huán)系統(tǒng)的重要輔助部分，它可將腎組織間隙中多余的液體、淋巴細胞、電解質和蛋白質運送回血液系統(tǒng)，對于維持體液穩(wěn)定起著重要作用。關于淋巴循環(huán)的研究已有300余年的歷史，但是其研究進展遠遠落后于其他系統(tǒng)。我們現在已經明確了淋巴管及淋巴結的分布及走行，對淋巴的組成及調節(jié)有了測定，初步建立了淋巴循環(huán)的體系，但是對于淋巴管的發(fā)生、形態(tài)、功能及調節(jié)的認識還遠遠不夠?？梢哉f，與循環(huán)系統(tǒng)及神經系統(tǒng)相比，淋巴

2、系統(tǒng)并未引起人們足夠的重視。在腎臟移植手術中，淋巴管往往不予以結扎。此外，很多臨床疾病及臨床操作如炎癥、腫瘤、創(chuàng)傷及外科手術等亦可以損傷淋巴循環(huán)。對于淋巴循環(huán)的有限認識有礙于醫(yī)學的發(fā)展。目前淋巴循環(huán)的研究已經逐漸起步，關于心、腦、肝及胃腸等器官淋巴循環(huán)障礙的報導已見報端，但是關于腎臟淋巴循環(huán)障礙的研究甚少。
　　 早期研究表明，腎門淋巴管急性結扎對腎功能有顯著影響。此外，胸導管結扎可以導致腎實質彌漫性硬化。但是我們對于腎淋巴管的

3、了解依然有限，而且在腎移植手術中，淋巴管的重要性常被忽略。我們的前期研究發(fā)現腎淋巴管結扎后大鼠出現腎功能不全、蛋白尿及腎小管上皮細胞凋亡，但是其作用機制仍待進一步研究。
　　 慢性腎臟衰竭的進展主要表現為腎臟細胞丟失及腎臟細胞被細胞外基質及成纖維細胞取代。近年來，凋亡已被證實參與腎臟細胞丟失過程。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，是機體的一種正常細胞的更新和異常細胞清除，而在病理狀態(tài)下異常的凋亡又與眾多系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。眾

4、所周知，凋亡是一個復雜的過程，主要有兩條途徑--內源性途徑和外源性途徑。內源性凋亡途徑又稱線粒體/細胞色素C(cytochrome c，Cytc)途徑，線粒體是細胞生命活動的控制中心，它不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，還是細胞凋亡調控的中心。當線粒體受到細胞內損傷如氧化應激時，內源性途徑被激活。Bcl-2家族促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白比例增高，線粒體膜的通透性增加。細胞色素C釋放入胞漿并激活下游細胞凋亡途徑，最終激活“執(zhí)行caspase

5、”-caspase3，從而誘導細胞凋亡。外源性凋亡途徑又稱為死亡受體通路，是由胞外腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族的死亡配體引發(fā)的。腫瘤壞死因子家族配體如Fas受體(Fas ligand，FasL)結合到其受體上并激活caspase8，繼而激活下游“執(zhí)行caspase”，比如caspase3，導致細胞凋亡。我們已經證實腎淋巴管結扎后大鼠出現腎小管上皮細胞凋亡，那么在這個過程中兩條凋亡途徑起著什么樣

6、的作用呢?其凋亡的機制又如何呢?
　　 為了闡明腎淋巴管結扎與。腎臟疾病進展、腎臟細胞凋亡的關系以及哪些基因和蛋白參與其中，我們以腎淋巴循環(huán)障礙的單腎切除大鼠為模型，做了以下研究。
　　 目的:
　　 1.構建腎淋巴循環(huán)障礙大鼠模型；
　　 2.觀察腎淋巴循環(huán)障礙對大鼠的影響；
　　 3.探討腎淋巴循環(huán)障礙所致腎小管上皮細胞凋亡的機制。
　　 研究方法:
　　 1.動物模型建立：<

7、br>　　 選取250-300g雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，適應性喂養(yǎng)7天。54只大鼠隨機分為三組：KL組(n=18)，KN組(n=18)及sham組(n=18)。動物處理如下：KL組大鼠，切除右腎并結扎左腎腎門淋巴管及左腎上下極脂肪纖維組織；KN組大鼠，手術步驟同前，只是不結扎淋巴管；sham組大鼠，開腹后隨即縫合，不結扎腎臟淋巴管亦不切除腎臟。腎淋巴管結扎方法簡介如下：在外科顯微鏡下于腎被膜下及腎實質內注射2％E

8、vans藍，淋巴管顯示清楚后結扎腎門淋巴管及腎上下極脂肪纖維組織。各組大鼠分別于術后第1、7、14天各處死6只。收取腎臟標本、24小時尿液及血標本。
　　 2.蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色：
　　 腎臟組織在4％多聚甲醛中固定，經常規(guī)脫水、石蠟包埋后制成4μm厚切片。取石蠟切片經脫蠟、水化、HE染色、脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察。
　　 3.細胞凋亡檢測：
　　

9、組織切片制作處理方法如上，使用腎臟細胞原位凋亡(TUNEL)試劑盒進行凋亡檢測，所有操作均按照產品說明書進行。每張玻片任選10個獨立高倍視野計數凋亡細胞，每100個細胞內的凋亡細胞數以百分數表示為細胞凋亡指數。
　　 4.腎臟氧化應激檢測：
　　 選取新鮮腎臟組織，提取組織蛋白并并用Bradford法測定蛋白濃度，采用相應ELISA試劑盒檢測腎臟組織活性氧(ROS)產生水平，測定450 nm及620 nm處吸光度，以62

10、0 nm處吸光度為參照；丙二醛(MDA)測定采用硫代巴比妥酸法，測定532nm處吸光度后根據公式進行計算；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測采用黃嘌呤氧化酶法，測定550hm處吸光度后根據公式進行計算；所有操作均按照試劑說明書進行。
　　 5.實時熒光定量PCR檢測：
　　 腎臟組織置于RNA保護液中保存，采用Trizol法提取腎臟組織總RNA，ABI7500機器實時熒光定量檢測Bax、Bcl-2、FasL和Gapdh的m

11、RNA表達。Gapdh用作管家基因。
　　 6.Western blot檢測：
　　 取腎臟新鮮組織，采用組織總蛋白提取試劑盒提取。腎臟組織總蛋白，Western blot檢測Bax、Bcl-2、FasL蛋白表達水平；采用胞漿蛋白提取試劑盒提取腎臟組織胞漿蛋白，Western blot檢測細胞色素C(cytc)的蛋白表達水平。
　　 7.caspase8、caspase9及caspase3的活性檢測：
　　

12、 采用相應活性檢測試劑盒檢測caspase8、caspase9及caspase3活性。取新鮮組織，按照產品說明書制作組織裂解液，加入反應體系孵育后測定405nm處吸光度，根據標準曲線進行計算。
　　 8.統(tǒng)計學分析：
　　 采用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析，組間均數的比較采用方差齊性檢驗與單因素方差分析，定量數據用均數±標準差(x±s)表示，檢驗水平α=0.05。
　　 1.腎臟功能變化：
　　

13、結果:
　　 Sham組的腎功能在整個實驗中沒有明顯變化，與之相比，KL組及KN組尿蛋白及血肌酐水平自術后第7日起明顯增高(P<0.05)。術后第14日，KN組尿蛋白及血肌酐水平回落至正常水平，與sham組相比無明顯差異，而KL組的尿蛋白及血肌酐水平則繼續(xù)增高(P<0.01)。
　　 2.蘇木素伊紅(HE)染色：
　　 HE染色表明KL組有明顯的腎小管上皮細胞退化、脫落及萎縮現象；而KN組類似組織改變不如KL組明

14、顯；sham組未見上述組織改變。
　　 3.凋亡檢測：
　　 Sham組中罕見凋亡細胞；KL組細胞凋亡指數從術后第1日起開始增多(P<0.05)并在術后第14日達到頂峰(P<0.01)；KN組細胞凋亡指數自術后第7日明顯增高(P<0.05)，之后維持在較高水平(P<0.05)，并未進一步增高。與KL組相比，KN組各時間點細胞凋亡指數均較低(P<0.05)。
　　 4.腎臟ROS、MDA及SOD水平：
　　

15、 與sham組相比，KL組ROS水平自術后第1日起開始增高并維持在一個較高的水平(P<0.05)，術后第7日起KL組腎臟MDA水平增高(P<0.05)而SOD活性水平降低(P<0.05)。而KN組與sham組相比，以上指標在各時間點未見明顯異常。
　　 5.Bax、Bcl-2、FasL基因表達：
　　 實時熒光定量PCR結果顯示，與sham組相比，KL組Bax及FasL mRNA表達水平自術后第1天起明顯增高(P<0.0

16、5)并在術后第14天達到高峰(P<0.01)，而Bcl-2 mRNA表達水平自術后第1天起明顯降低(P<0.05)并一直低于sham組(P<0.01)。與sham組相比，KN組Bax及Bcl-2 mRNA表達水平無明顯變化；而FasL mRNA表達水平自術后第7日起明顯高于sham組(P<0.05)，但仍低于KL組(P<0.05)。
　　 6.Bax、Bcl-2、cytc及FasL蛋白表達：
　　 Western結果顯示

17、，與sham組相比，KL組Bax、cytc及FasL蛋白表達水平自術后第1天起明顯增高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達水平自術后第1天起明顯降低(P<0.05)。與sham組相比，KN組FasL蛋白表達水平自術后第7天起明顯增高(P<0.05)，但仍低于KL組(P<0.05)。而KN組的Bax、cytc及Bcl-2蛋白表達水平與sham組相比無明顯差異。
　　 7.caspase8、caspase9及caspase3的活性

18、：
　　 與sham組相比，KL組caspase8、caspase9及caspase3的活性自術后第一日起增高并保持在較高水平(P<0.05)。KN組caspase8活性自術后第7日起較sham組明顯增高(P<0.05)，但仍低于KL組(P<0.05)。而KN組caspase9及caspase3的活性與sham組相比無明顯變化。
　　 結論:
　　 1.我們證實了腎臟淋巴循環(huán)障礙可以導致腎臟功能減退及腎臟細胞凋亡