復方黃甘對5-6腎切除大鼠的腎臟保護作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬通過建立HPLC指紋圖譜，并利用HPLC-QTOF/MS技術對復方黃甘的復雜化學成分進行定性和定量分析，在初步闡明復方中的物質基礎之上，進一步采用5/6腎切除法構建CKD大鼠模型，確切復方黃甘的藥效，并從體內和體外實驗研究復方黃甘對Wnt/β-catenin信號通路的干預作用，初步探討其抗腎臟纖維化的可能作用機制，為其臨床治療CKD提供新的思路和可靠的實驗依據。
　　方法：
　　(1)通過醇提和水提

2、醇沉合并工藝，制備復方黃甘提取物。
　　(2)利用5/6腎切除法構建CKD大鼠模型，并于給藥前（術后2周）檢測5/6腎切除模型組與假手術組的血清Scr、BUN水平，檢驗模型是否成功。
　　(3)取藥效實驗部分大鼠腎組織，分別提取組織中RNA與總蛋白。
　　(4)HK-2細胞上皮間充質轉化(EMT)模型的構建
　　結果：
　　1.復方黃甘物質基礎研究
　　(1)經提取干燥后復方黃甘1g浸膏相當于4.6g

3、原藥材。采用PDA檢測器在200～400nm全波長掃描，發(fā)現復方黃甘在254nm處有最大吸收，特征峰明顯且峰型與分離度都較好。采用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A)”，根據10批次樣本的HPLC圖譜生成對照指紋圖譜，共標示出21個共有峰，共有峰的面積占總面積93％以上。10批次復方黃甘具有較好的一致性，提取方法穩(wěn)定，利用紫外HPLC指紋圖譜能較好的控制復方黃甘整體質量。
　　(2)采用HPLC-QTOF/

4、MS檢測分析，從質譜總離子流圖中通過自動尋找和手動匹配的方法，共得到38種響應化合物，其中以正離子模式11個化學成分，負離子模式27個化學成分。通過與標準品的色譜保留時間對比分析及質譜分子離子峰與碎片峰對比分析確定，主要的8種化合物分別為甘草苷、射干苷、木樨草素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚。
　　(3)用HPLC標準曲線法測得復方黃甘中主要8各成分的含量分別為:甘草苷(0.167％)、射干苷(1.98％)、木樨

5、草素(1.03％)、蘆薈大黃素(3.78％)、大黃酸(3.13％)、大黃素(1.54％)、大黃酚(2.72％)、大黃素甲醚(1.55％)。
　　2.復方黃甘藥效學研究
　　(1)造模2周后，腎切除大鼠Scr與BUN水平都顯著高于假手術組(P＜0.001)，提示造模成功。給藥期間，各實驗組大鼠的體重無顯著性差異，且呈逐漸上升趨勢。
　　(2)血清生化指標:各實驗組數據均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析進行組間的多重比較。

6、統計結果顯示:給藥12周后，模型組大鼠腎臟指數（RI）、Scr、BUN、UPr都顯著高于假手術組和本底對照組（P＜0.01），肌酐清除率(Ccr)顯著低于假手術組和本底對照組（P＜0.05）。假手術組和本底對照組之間各項生化指標均無顯著性差異（P＞0.05）。各實驗組大鼠間RI、Scr、BUN、Ccr、UPr水平均有顯著性差異（F=4.044，P=0.001;F=58.951，P＜0.001;F=114.147，P＜0.001;F=4.

7、113，P=0.001;F=6.108，P＜0.001）:各給藥組RI均顯著低于模型組(P＜0.001)，復方黃甘中、高劑量組BUN均顯著低于模型組（P＜0.05），且其三個劑量組均顯著低于氯沙坦組（P＜0.01），中、高劑量組Scr顯著低于模型組(P＜0.05)，復方黃甘低高劑量組Ccr水平均顯著高于模型組與氯沙坦組(P＜0.05)，而復方黃甘低、中、高劑量組UPr顯著低于模型組(P＜0.05)，但低、高劑量組高于氯沙坦組(P＜0.0

8、1)。復方黃甘三個劑量組RI、Scr、BUN、Ccr、UPr水平與尿毒清組均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　(3)各個給藥組CHOL與LDL均顯著低于模型組（P＜0.05），但除了氯沙坦組的CHOL水平（P=0.971）。復方黃甘低、中、高劑量組均能降低腎組織中MDA水平、升高SOD、T-AOC、CAT以及GSH-PX，與模型組均有統計學差異(P＜0.05)。血清AOPP水平復方黃甘低、中、高劑量組都顯著低于模型組(P＜0.0

9、01)，且中、高劑量組顯著低于尿毒清組(P＜0.001)與氯沙坦組(P＜0.01)。
　　(4)HE與Masson染色結果顯示:術后15周，假手術組與本底對照組大鼠腎組織未見明顯病理改變。復方黃甘組炎性細胞浸潤、小管萎縮、腎小球硬化與間質纖維化等癥狀都有明顯的不同程度的減輕。
　　3.復方黃甘對CKD大鼠腎組織Wnt/β-catenin信號通路的影響
　　(1)RT-PCR結果顯示:各實驗組大鼠腎組織Wnt1、β-ca

10、tenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fn1 mRNA表達水平差異均有統計學意義（F=3.784，P=0.004;F=9.140，P＜0.001; F=9.781，P＜0.001; F=7.004，P＜0.001; F=8.059，P＜0.001;F=2.858，P=0.021）。復方黃甘低、中、高劑量組均顯著抑制Wnt1、β-catenin、Tcf4以及Fn1 mRNA的表達，差異均有統計學意義(P＜0.05)。同時，與假手

11、術組和本底對照比較，復方黃甘三個劑量組均能上調Gsk-3β與Dkk1 mRNA水平(P＜0.01，P＜0.05)）。
　　(2)Westem blot蛋白表達結果與RT-PCR結果相吻合:與模型組比較，復方黃甘低、中、高劑量組都顯著抑制Wnt1（P＜0.001）、β-catenin(P＜0.05)、Tcf4（P＜0.05）以及Fn1(P＜0.001)蛋白的表達，且假手術組與本底對照組間Wnt1、β-catenin、Tcf4、Dkk

12、1、Fn1蛋白以及Gsk-3β磷酸化水平均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　(3)免疫組化結果顯示:Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1、以及Fn1蛋白在假手術組與模型組均有表達，但假手術組表達范圍小、色澤淺，表達量相對較弱。Wnt1、Dkk1與Tcf4三種蛋白的表達部位相似，主要集中在腎小管上皮細胞以及腎小球系膜細胞，且在腎小球中表達更強。β-catenin與Gsk-3β則主要表達在腎小球系膜細胞與遠

13、曲小管上皮細胞中。而Fn1主要在腎小球系膜細胞、基底膜以及腎小管間質中表達，這正是構成小管間質纖維化的主要原因。而半定量的結果與RT-PCR和westemblot結果大體一致。
　　4.復方黃甘通過Wnt通路對HK-2細胞EMT的干預作用
　　(1)復方黃甘對HK-2細胞作用48h后的最大安全濃度為200ug/ml。高糖誘導HK-2細胞12、24、48h后，EMT標志性蛋白α-SMA與Wnt通路關鍵蛋白β-catenin的表

14、達逐漸升高，而甘露醇(HM)組與正常對照組(NC)在處理時間內，都無明顯表達。說明高糖能誘導HK-2發(fā)生EMT，且能激活Wnt通路相關蛋白的表達，高糖高滲透壓對目的蛋白的表達無影響。
　　(2)RT-PCR檢測結果顯示:高糖誘導HK-2細胞12、24、48h，并同時給予藥物處理，在12h前Wnt1、β-catenin、Tcf4、α-SMA、Fn1 mRNA的表達都較弱，藥物抑制作用不明顯。在24～48h間，Wnt通路激活達到高峰。

15、統計結果顯示:高糖誘導HK-2細胞48h后，高糖模型組(HG) Wnt1 mRNA表達水平較正常組顯著升高（P＜0.001），ICG-001陽性對照組能顯著抑制其表達(vs.HGP＜0.001)，復方黃甘高、低劑量組亦有此抑制表達的作用（P=0.01，P=0.02），且與ICG-001組無顯著性差異（P=0.276，P=0.122），但復方黃甘高、低劑量組間無統計學差異（P=0.601）。而各個給藥組對β-catenin、Tcf4、α-

16、SMA、Fn1 mRNA的表達，均表現出了與Wnt1同樣的抑制趨勢，且差異有統計學意義（P＜0.05）。
　　(3)Western blot結果顯示:高糖誘導HK-2細胞48h后，Wnt通路相關蛋白顯著上調，α-SMA與Fn1分泌增多。ICG-001陽性對照與復方黃甘高、低劑量組均能抑制該通路相關蛋白的表達，降低HK-2細胞在EMT過程中分泌的α-SMA與Fn1，差異均有統計學意義。而在細胞免疫熒光實驗中也同樣證明，復方黃甘高、低

17、劑量組均能降低α-SMA與β-catenin的表達。
　　結論：
　　(1)復方黃甘提取物的制備方法穩(wěn)定可靠，不同批次復方黃甘提取物具有較好的一致性，通過建立HPLC指紋圖譜能較好的控制復方黃甘整體質量。
　　(2)利用Q-TOF/MS與HPLC方法，解析并測定復方中主要成分及其含量，基本明確了復方黃甘作用的物質基礎，提高了復方黃甘質量控制水平與標準。
　　(3)復方黃甘能有效保護5/6腎切除大鼠殘余腎功能，顯著