大鼠急性脊髓損傷后緊密連接與血管發(fā)生在血—脊髓屏障功能缺失中的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是嚴(yán)重危害人類生存和生活質(zhì)量的一類中樞性神經(jīng)創(chuàng)傷。隨著全民運(yùn)動(dòng)的日益普及和越來越頻繁的交通運(yùn)輸活動(dòng)，脊髓損傷的發(fā)生率近年來有了顯著的增高。研究表明，脊髓損傷后微循環(huán)障礙導(dǎo)致的脊髓缺血-水腫-自由基變化-水腫-缺血加重的惡性循環(huán)是造成脊髓神經(jīng)組織不可逆的變性、壞死和細(xì)胞凋亡的主要過程之一。在這一過程中，血-脊髓屏障(bloodspinal cord bar

2、rier，BSCB)功能缺失導(dǎo)致的血管滲透性增加是該惡性循環(huán)中的關(guān)鍵事件。本研究定性定量評(píng)估SCI前后脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接的超微結(jié)構(gòu)變化和緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1以及新生血管的空間分布和表達(dá)，探討緊密連接與血管發(fā)生在脊髓損傷后BSCB功能改變中的作用和相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1.80只SD大鼠用于本實(shí)驗(yàn)。20只SD大鼠作為正常組，60只SD大鼠利用改良Allen's打擊方法構(gòu)建脊髓損傷模型后，隨機(jī)分

3、為損傷后1天組，3天組，7天組，每組20只。獲取正常組和上述各時(shí)間點(diǎn)胸10(T10)段脊髓組織用于以下檢測。
　　2.利用透射電子顯微鏡觀察正常與脊髓損傷后1天、3天、7天SD大鼠T10段脊髓微血管緊密連接超微結(jié)構(gòu)。各時(shí)間點(diǎn)樣品數(shù)4只，共16只。
　　3.利用組織免疫熒光技術(shù)和Western Blotting技術(shù)，對(duì)正常與脊髓損傷后1天、3天、7天SD大鼠T10段脊髓緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1的空間分布與表達(dá)進(jìn)

4、行定性定量評(píng)估。蛋白熒光分析采用ImagePro Plus軟件。各時(shí)間點(diǎn)樣品數(shù)4只，共32只，其中16只用于組織免疫熒光分析，余16只用于Western Blotting分析。
　　4.利用組織免疫熒光技術(shù)，對(duì)正常與脊髓損傷后1天、3天、7天SD大鼠血管發(fā)生標(biāo)記CD34+細(xì)胞的空間分布與表達(dá)進(jìn)行2D評(píng)估。蛋白熒光分析采用ImagePro Plus軟件。各時(shí)間點(diǎn)樣品數(shù)4只，共16只。CD34分別與緊密連接蛋白Claudin-5、ZO

5、-1熒光共標(biāo)記。
　　5.通過活體注射EB染料，在熒光顯微鏡下觀察正常與脊髓損傷后1天、3天、7天BSCB滲透性變化，定性分析正常組及脊髓損傷后各時(shí)間點(diǎn)BSCB功能。同時(shí)借助分光光度儀檢測脊髓組織中EB含量，定量評(píng)估正常組及脊髓損傷后1天、3天、7天BSCB功能。各時(shí)間點(diǎn)樣品數(shù)4只，共32只，其中16只用于定性分析，余16只用于定量評(píng)估。
　　6.以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用SPSS13.0軟件，組間比較使用T檢驗(yàn)，P＜0.05具

6、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.緊密連接
　　透射電鏡觀察證實(shí)，正常組大鼠脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接呈鉚釘狀結(jié)構(gòu)，構(gòu)成相對(duì)封閉的血管管腔。在急性脊髓損傷后，細(xì)胞間緊密連接開放，在3天時(shí)細(xì)胞間隙增寬最為顯著，之后隨時(shí)間延續(xù)逐漸恢復(fù)，但在7天時(shí)仍未達(dá)到正常水平。
　　2.緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1
　　組織免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常組脊髓，緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1均與血管分布呈現(xiàn)

7、高度一致性。在SCI后1天、3天、7天，上述蛋白均出現(xiàn)分布異常與不同程度的表達(dá)下降。其中在損傷后1天最為顯著，之后隨損傷時(shí)間延續(xù)逐漸恢復(fù)，但在SCI后7天，仍未恢復(fù)正常水平。Western Blotting結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，在SCI后1天，Claudin-5、ZO-1蛋白較正常組顯著下降，并在SCI后3天、7天逐漸恢復(fù)，但7天時(shí)仍未達(dá)到正常水平。
　　3.CD34+細(xì)胞分布與表達(dá)
　　組織免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常組脊髓，CD34

8、+細(xì)胞分布于血管內(nèi)皮。在SCI后，CD34+細(xì)胞在損傷中心區(qū)域分布缺失，同時(shí)出現(xiàn)不同程度表達(dá)下降，在脊髓損傷后1天最為顯著，之后隨損傷時(shí)間延續(xù)逐漸恢復(fù)，但在SCI后7天時(shí)仍未恢復(fù)正常水平。在脊髓損傷后3天，損傷中心區(qū)域出現(xiàn)少量CD34+細(xì)胞。在損傷后7天，損傷中心區(qū)域可見大量CD34+細(xì)胞表達(dá)。
　　4.BSCB滲透性
　　正常大鼠脊髓幾乎無法觀察到EB的滲出。在脊髓損傷后1、3、7天，出現(xiàn)了不同程度的EB滲出，其中損傷后3

9、天時(shí)EB的滲出最為顯著。定量結(jié)果顯示脊髓損傷后1天即出現(xiàn)了組織EB含量的增加，在損傷后3天，組織EB含量最多，與定性觀察結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠脊髓損傷后脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1出現(xiàn)分布異常與表達(dá)下降，在損傷后1天最為顯著，之后逐漸恢復(fù)。
　　2.大鼠脊髓損傷后脊髓血管網(wǎng)絡(luò)被破壞，在損傷后1天最為顯著;在損傷后3天出現(xiàn)損傷中心區(qū)域血管發(fā)生。
　　3.大鼠脊髓損傷后BSC