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文檔簡介
1、研究背景與目的:
脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是嚴(yán)重危害人類生存和生活質(zhì)量的一類中樞性神經(jīng)創(chuàng)傷。隨著全民運(yùn)動(dòng)的日益普及和越來越頻繁的交通運(yùn)輸活動(dòng),脊髓損傷的發(fā)生率近年來有了顯著的增高。研究表明,脊髓損傷后微循環(huán)障礙導(dǎo)致的脊髓缺血-水腫-自由基變化-水腫-缺血加重的惡性循環(huán)是造成脊髓神經(jīng)組織不可逆的變性、壞死和細(xì)胞凋亡的主要過程之一。在這一過程中,血-脊髓屏障(bloodspinal cord bar
2、rier,BSCB)功能缺失導(dǎo)致的血管滲透性增加是該惡性循環(huán)中的關(guān)鍵事件。本研究定性定量評(píng)估SCI前后脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接的超微結(jié)構(gòu)變化和緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1以及新生血管的空間分布和表達(dá),探討緊密連接與血管發(fā)生在脊髓損傷后BSCB功能改變中的作用和相關(guān)機(jī)制。
方法:
1.80只SD大鼠用于本實(shí)驗(yàn)。20只SD大鼠作為正常組,60只SD大鼠利用改良Allen's打擊方法構(gòu)建脊髓損傷模型后,隨機(jī)分
3、為損傷后1天組,3天組,7天組,每組20只。獲取正常組和上述各時(shí)間點(diǎn)胸10(T10)段脊髓組織用于以下檢測。
2.利用透射電子顯微鏡觀察正常與脊髓損傷后1天、3天、7天SD大鼠T10段脊髓微血管緊密連接超微結(jié)構(gòu)。各時(shí)間點(diǎn)樣品數(shù)4只,共16只。
3.利用組織免疫熒光技術(shù)和Western Blotting技術(shù),對(duì)正常與脊髓損傷后1天、3天、7天SD大鼠T10段脊髓緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1的空間分布與表達(dá)進(jìn)
4、行定性定量評(píng)估。蛋白熒光分析采用ImagePro Plus軟件。各時(shí)間點(diǎn)樣品數(shù)4只,共32只,其中16只用于組織免疫熒光分析,余16只用于Western Blotting分析。
4.利用組織免疫熒光技術(shù),對(duì)正常與脊髓損傷后1天、3天、7天SD大鼠血管發(fā)生標(biāo)記CD34+細(xì)胞的空間分布與表達(dá)進(jìn)行2D評(píng)估。蛋白熒光分析采用ImagePro Plus軟件。各時(shí)間點(diǎn)樣品數(shù)4只,共16只。CD34分別與緊密連接蛋白Claudin-5、ZO
5、-1熒光共標(biāo)記。
5.通過活體注射EB染料,在熒光顯微鏡下觀察正常與脊髓損傷后1天、3天、7天BSCB滲透性變化,定性分析正常組及脊髓損傷后各時(shí)間點(diǎn)BSCB功能。同時(shí)借助分光光度儀檢測脊髓組織中EB含量,定量評(píng)估正常組及脊髓損傷后1天、3天、7天BSCB功能。各時(shí)間點(diǎn)樣品數(shù)4只,共32只,其中16只用于定性分析,余16只用于定量評(píng)估。
6.以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用SPSS13.0軟件,組間比較使用T檢驗(yàn),P<0.05具
6、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
結(jié)果:
1.緊密連接
透射電鏡觀察證實(shí),正常組大鼠脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接呈鉚釘狀結(jié)構(gòu),構(gòu)成相對(duì)封閉的血管管腔。在急性脊髓損傷后,細(xì)胞間緊密連接開放,在3天時(shí)細(xì)胞間隙增寬最為顯著,之后隨時(shí)間延續(xù)逐漸恢復(fù),但在7天時(shí)仍未達(dá)到正常水平。
2.緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1
組織免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),在正常組脊髓,緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1均與血管分布呈現(xiàn)
7、高度一致性。在SCI后1天、3天、7天,上述蛋白均出現(xiàn)分布異常與不同程度的表達(dá)下降。其中在損傷后1天最為顯著,之后隨損傷時(shí)間延續(xù)逐漸恢復(fù),但在SCI后7天,仍未恢復(fù)正常水平。Western Blotting結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn),在SCI后1天,Claudin-5、ZO-1蛋白較正常組顯著下降,并在SCI后3天、7天逐漸恢復(fù),但7天時(shí)仍未達(dá)到正常水平。
3.CD34+細(xì)胞分布與表達(dá)
組織免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),在正常組脊髓,CD34
8、+細(xì)胞分布于血管內(nèi)皮。在SCI后,CD34+細(xì)胞在損傷中心區(qū)域分布缺失,同時(shí)出現(xiàn)不同程度表達(dá)下降,在脊髓損傷后1天最為顯著,之后隨損傷時(shí)間延續(xù)逐漸恢復(fù),但在SCI后7天時(shí)仍未恢復(fù)正常水平。在脊髓損傷后3天,損傷中心區(qū)域出現(xiàn)少量CD34+細(xì)胞。在損傷后7天,損傷中心區(qū)域可見大量CD34+細(xì)胞表達(dá)。
4.BSCB滲透性
正常大鼠脊髓幾乎無法觀察到EB的滲出。在脊髓損傷后1、3、7天,出現(xiàn)了不同程度的EB滲出,其中損傷后3
9、天時(shí)EB的滲出最為顯著。定量結(jié)果顯示脊髓損傷后1天即出現(xiàn)了組織EB含量的增加,在損傷后3天,組織EB含量最多,與定性觀察結(jié)果一致。
結(jié)論:
1.大鼠脊髓損傷后脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1出現(xiàn)分布異常與表達(dá)下降,在損傷后1天最為顯著,之后逐漸恢復(fù)。
2.大鼠脊髓損傷后脊髓血管網(wǎng)絡(luò)被破壞,在損傷后1天最為顯著;在損傷后3天出現(xiàn)損傷中心區(qū)域血管發(fā)生。
3.大鼠脊髓損傷后BSC
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