神經(jīng)干細(xì)胞移植促進(jìn)創(chuàng)傷性損傷組織修復(fù)及其機(jī)制的研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、前言:
   創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)專指由外傷引起的腦組織損害,又稱顱腦損傷或頭部外傷。TBI是世界范圍內(nèi)死亡和致殘的主要原因,特別是兒童和青年人。TBI的全球發(fā)病率正在增加,特別是在發(fā)展中國(guó)家。嚴(yán)重的TBI會(huì)立即導(dǎo)致神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞受損以及和相關(guān)的神經(jīng)功能障礙,包括認(rèn)知、情感和行為障礙,致殘率高、死亡率高。20世紀(jì)在診斷和治療領(lǐng)域的重大進(jìn)展已經(jīng)明顯降低了死亡率。這種因TBI引起

2、的死亡率的下降導(dǎo)致了殘疾人口數(shù)量隨之增加,給社會(huì)和家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)。對(duì)TBI造成的組織損傷后的修復(fù)治療是當(dāng)前腦研究的熱點(diǎn)。
   研究表明,由創(chuàng)傷后的數(shù)分鐘至數(shù)天內(nèi)發(fā)生的一系列復(fù)雜的細(xì)胞生物化學(xué)過(guò)程導(dǎo)致了繼發(fā)性損傷。這一繼發(fā)過(guò)程可能是治療失敗、并成為在院TBI病人死亡的最主要原因。目前,尚沒有任何藥物可以阻止繼發(fā)性損傷的進(jìn)展。由于神經(jīng)保護(hù)性治療可以限制。TBI后的損傷程度,停止或減輕繼發(fā)性損傷,已經(jīng)受到了極大的關(guān)

3、注。然而,臨床試驗(yàn)中測(cè)試的可能阻止這些細(xì)胞損傷機(jī)制的方法在很大程度上都失敗了。
   近年來(lái)對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralsterncells,NSCs)或神經(jīng)前體細(xì)胞(neuralprogenitorcells,NPCs)的研究為應(yīng)用這些細(xì)胞治療腦損傷成為可能,TBI后的功能網(wǎng)絡(luò)重建已成為干細(xì)胞治療的目的之一。我們前期的研究表明,在選擇性的感覺運(yùn)動(dòng)功能試驗(yàn)中,NSCs移植治療大鼠TBI后第1周,就起到了促進(jìn)功能恢復(fù)的作用。盡管目

4、前體內(nèi)研究表明移植的NSCs會(huì)與受損的內(nèi)源性神經(jīng)元發(fā)生相互作用,但其具體作用機(jī)制尚不清楚。有研究認(rèn)為這種對(duì)宿主細(xì)胞的保護(hù)和解救措施與NSCs釋放的某些保護(hù)因子或特殊神經(jīng)介質(zhì)以及存在于損傷腦組織中的細(xì)胞間信號(hào)有關(guān),然而,僅憑這一機(jī)制尚不足以闡明NSCs在移植中發(fā)揮的有利作用。
   因此,本研究應(yīng)用改良的Feeney法制備TBI動(dòng)物模型,NSCs腦內(nèi)移植后,于不同時(shí)間采用免疫組織化學(xué)、RT-PCR和免疫印跡等方法檢測(cè)移植點(diǎn)及其周圍

5、腦組織中細(xì)胞連接、細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的表達(dá)改變,探討移植促進(jìn)組織修復(fù)的相關(guān)機(jī)制,旨在為推廣臨床應(yīng)用NSCs移植治療TBI提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
   方法:
   從E14SD大鼠胚胎分離NSCs,進(jìn)行原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng);用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基對(duì)NSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化;采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)的NSCs和其分化為神經(jīng)元的表型進(jìn)行鑒定。采用改良的Feeney法制備創(chuàng)傷性腦損傷模型。利用腦立體定位儀和微量注射泵進(jìn)行NS

6、Cs腦內(nèi)移植。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫印跡技術(shù)和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)在移植后不同時(shí)間腦組織損傷區(qū)縫隙連接蛋白43(connexin43,Cx43)、整合素(integrin)的表達(dá)。構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA-BDNF,采用非脂質(zhì)體的脂類轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染NSCs,應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)、激光共聚焦掃描顯微鏡和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞BDNF和Nestin的表達(dá)和共存。分別將BDNF轉(zhuǎn)染的NSCs(BDNF/NSCs)和天然NSCs移植于TB

7、I動(dòng)物腦內(nèi),比較BDNF/NSCs與NSCs于移植后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)腦組織損傷區(qū)BDNF和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(grow-associatedprotein43,GAP43)mRNA和蛋白表達(dá)的改變。
   結(jié)果:
   1、在培養(yǎng)基中,NSCs呈球團(tuán)狀懸浮生長(zhǎng),Nestin表達(dá)陽(yáng)性。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基對(duì)NSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化,發(fā)現(xiàn)分化后第2天,多數(shù)細(xì)胞伸出突起,以后突起逐漸延長(zhǎng),分支增加。分化后第5d,部分細(xì)胞呈βⅢ-微

8、管蛋白陽(yáng)性。
   2、免疫組織化學(xué)顯示,無(wú)論有無(wú)NSCs移植,在移植后第1、2和4w的受損腦組織中,均可見Cx43在細(xì)胞膜上、膜旁的胞漿里及在突起中呈棕黃色表達(dá)。NSCs移植大鼠的Cx43染色在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)。NSCs移植大鼠Cx43的mRNA表達(dá)相對(duì)值在1、2和4w分別為1.38±0.08,1.69±0.10和1.53±0.09;對(duì)照組大鼠Cx43的mRNA表達(dá)分別為0.55±0.14、0.91±

9、0.08和0.42±0.07。在移植后的4w內(nèi),在NSCs移植組移植點(diǎn)及其周圍腦組織中Cx43的mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。
   3、整合素陽(yáng)性產(chǎn)物主要表達(dá)于細(xì)胞膜,呈棕黃色。在對(duì)照組及移植組均可見陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。在不同時(shí)間點(diǎn),NSCs移植組整合素陽(yáng)性細(xì)胞均顯著多于對(duì)照組,同一時(shí)間點(diǎn)兩組間比較,差異有顯著性意義(P<0.05)。NSCs移植組大鼠移植點(diǎn)及周圍腦組織中整合素的mRNA表達(dá)相對(duì)值在1、2和4w分

10、別為1.7l±0.07,1.92±0.11和1.83±0.08。對(duì)照組分別為0.81±0.06、1.25±0.07和1.17±0.09。在NSCs移植組移植點(diǎn)及其周圍腦組織中整合素的mRNA表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。整合素的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)結(jié)果相一致。
   4、克隆測(cè)序結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒與參考序列完成一致,pcDNA3.1-BDNF質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳可見749bp和5.4kb兩

11、個(gè)條帶,其大小分別與載體pcDNA3.1和BDNFcDNA一致。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)藥物篩選后第10d,免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示部分細(xì)胞呈Nestin及BDNF雙重陽(yáng)性,RT-PCR檢測(cè)可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞中BDNF呈高表達(dá)(P<0.01)。
   5、RT-PCR和免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,在移植后第1、2w,BDNF/NSCs移植組損傷灶及周圍腦組織中的BDNF呈高表達(dá)。在移植后的4w內(nèi),與NSCs移植組相比,BDNF/NSCs移植組移植點(diǎn)及周圍腦組

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