譜學(xué)技術(shù)在免疫抑制藥物及相關(guān)蛋白研究中的應(yīng)用.pdf

1、光波譜技術(shù)在當(dāng)當(dāng)前生命科學(xué)研究領(lǐng)域中扮演重要角色。X-射線晶體衍射和多維核磁共振(NMR)是研究蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)構(gòu)的重要工具，熒光、紫外、紅外、拉曼及圓二色等光譜技術(shù)則在蛋白質(zhì)的構(gòu)象及功能研究中因其諸多優(yōu)點(diǎn)而不可或缺。本研究采用這些光譜技術(shù)研究免疫抑制藥物對相關(guān)蛋白的構(gòu)象調(diào)控機(jī)理。
　　器官移植是臨床治療器官功能衰竭的有效治療手段，免疫抑制劑的成功應(yīng)用是器官移植技術(shù)發(fā)展的有力保障。生物制劑類免疫抑制藥物棉子酚、環(huán)孢素和他克莫司

2、等可以通過與靶目標(biāo)蛋白鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶結(jié)合而有效地阻斷T細(xì)胞的增殖。這些藥物主要通過T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用于活化T細(xì)胞核因子(Nuclear Factor of Activated T-cells，NFAT)信號途徑，抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活性，阻止NFAT的去磷酸化，抑制白細(xì)胞介素2(Interleukin2，IL2)及其他細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calci

3、neurin, CN）是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca+-鈣調(diào)蛋白（Calmodulin, CaM）調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶，是TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵酶。本論文以各種譜學(xué)技術(shù)為研究手段，研究了棉籽酚、環(huán)孢素和他克莫司等常用免疫抑制藥物對CN及其相關(guān)蛋白的構(gòu)象調(diào)控機(jī)理。此外，我們用這些譜學(xué)技術(shù)對日常生活中常用蛋白如明膠、膠原蛋白等進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。具體研究內(nèi)容及研究成果包括:
　　一、利用紅外光譜和圓二色譜等譜學(xué)技術(shù)研究了Ca2+/C

4、aM調(diào)控CN的機(jī)理。CN是由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成的異二聚體結(jié)構(gòu)，位于活性中心自抑制區(qū)域?qū)τ贑N的活性調(diào)控具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，CN的調(diào)節(jié)區(qū)域大部分是無規(guī)則卷曲，但是這部分序列至少具有一定的結(jié)構(gòu)。調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域在晶體結(jié)構(gòu)信息中的缺失可能不是因為這段區(qū)域不具有結(jié)構(gòu)，而是這段序列結(jié)構(gòu)變化太快。Ca2+/CaM與CN結(jié)合引起CN的構(gòu)象發(fā)生一系列的變化，使CN二級結(jié)構(gòu)α螺旋顯著增加，結(jié)構(gòu)變得更加有序，CN折疊成更緊密，更疏水的構(gòu)象，通過空間阻礙阻

5、止自抑制區(qū)域與活性中心作用，從而被激活。
　　二、通過熒光淬滅研究棉子酚抑制CN的作用機(jī)理。棉籽酚可以與CN結(jié)合，非競爭性，可逆的抑制CN的磷酸酶活性。研究結(jié)果表明Ca2+和CaM可以誘導(dǎo)CN構(gòu)象發(fā)生變化，使其活性部位的暴露程度增加，從而激活其去磷酸化作用。在Ca2+存在條件下，隨著棉子酚濃度的增加，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性部位的暴露程度減小，其去磷酸化作用顯著降低，從而達(dá)到免疫抑制的作用。加入CaM后，棉子酚濃度的增加引起的熒光淬滅強(qiáng)