譜學技術在免疫抑制藥物及相關蛋白研究中的應用.pdf

1、光波譜技術在當當前生命科學研究領域中扮演重要角色。X-射線晶體衍射和多維核磁共振(NMR)是研究蛋白質等生物大分子結構的重要工具，熒光、紫外、紅外、拉曼及圓二色等光譜技術則在蛋白質的構象及功能研究中因其諸多優(yōu)點而不可或缺。本研究采用這些光譜技術研究免疫抑制藥物對相關蛋白的構象調控機理。
　　器官移植是臨床治療器官功能衰竭的有效治療手段，免疫抑制劑的成功應用是器官移植技術發(fā)展的有力保障。生物制劑類免疫抑制藥物棉子酚、環(huán)孢素和他克莫司

2、等可以通過與靶目標蛋白鈣調神經磷酸酶結合而有效地阻斷T細胞的增殖。這些藥物主要通過T細胞受體(T cell receptor, TCR)信號轉導通路作用于活化T細胞核因子(Nuclear Factor of Activated T-cells，NFAT)信號途徑，抑制鈣調神經磷酸酶的活性，阻止NFAT的去磷酸化，抑制白細胞介素2(Interleukin2，IL2)及其他細胞因子基因的轉錄，從而發(fā)揮免疫抑制效應。鈣調神經磷酸酶（Calci

3、neurin, CN）是迄今發(fā)現的唯一受Ca+-鈣調蛋白（Calmodulin, CaM）調節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白質磷酸酶，是TCR信號轉導通路的關鍵酶。本論文以各種譜學技術為研究手段，研究了棉籽酚、環(huán)孢素和他克莫司等常用免疫抑制藥物對CN及其相關蛋白的構象調控機理。此外，我們用這些譜學技術對日常生活中常用蛋白如明膠、膠原蛋白等進行了結構表征。具體研究內容及研究成果包括:
　　一、利用紅外光譜和圓二色譜等譜學技術研究了Ca2+/C

4、aM調控CN的機理。CN是由催化亞基和調節(jié)亞基構成的異二聚體結構，位于活性中心自抑制區(qū)域對于CN的活性調控具有重要意義。研究發(fā)現，CN的調節(jié)區(qū)域大部分是無規(guī)則卷曲，但是這部分序列至少具有一定的結構。調節(jié)結構域在晶體結構信息中的缺失可能不是因為這段區(qū)域不具有結構，而是這段序列結構變化太快。Ca2+/CaM與CN結合引起CN的構象發(fā)生一系列的變化，使CN二級結構α螺旋顯著增加，結構變得更加有序，CN折疊成更緊密，更疏水的構象，通過空間阻礙阻

5、止自抑制區(qū)域與活性中心作用，從而被激活。
　　二、通過熒光淬滅研究棉子酚抑制CN的作用機理。棉籽酚可以與CN結合，非競爭性，可逆的抑制CN的磷酸酶活性。研究結果表明Ca2+和CaM可以誘導CN構象發(fā)生變化，使其活性部位的暴露程度增加，從而激活其去磷酸化作用。在Ca2+存在條件下，隨著棉子酚濃度的增加，鈣調神經磷酸酶活性部位的暴露程度減小，其去磷酸化作用顯著降低，從而達到免疫抑制的作用。加入CaM后，棉子酚濃度的增加引起的熒光淬滅強