印記基因表達(dá)異常在非糖尿病性巨大兒中的作用及其機(jī)制.pdf

1、出生體重大于等于4000g的活產(chǎn)新生兒稱為巨大兒。隨著人們生活水平的不斷提高，巨大兒的發(fā)生率日益增加。巨大兒不僅會造成母體在分娩過程中受到損傷，而且會增加新生兒圍生期并發(fā)癥的發(fā)生，甚至影響兒童期和成年后的健康狀況，成年后更易忠心血管疾病、肥胖、糖尿病等代謝性疾病。巨大兒的發(fā)生雖與妊娠期糖尿病密切相關(guān)，但近年來隨著孕期糖尿病篩查工作的廣泛開展，糖尿病性巨大兒的發(fā)生率逐漸下降，而非糖尿病性巨大兒(NDFMS)的發(fā)生率呈不斷上升趨勢，但其具體

2、分子機(jī)制仍不清楚。因此，揭示NDFMS的發(fā)病機(jī)制，對提高母嬰健康水平具有重要意義。胎盤對胎兒的正常生長和發(fā)育至關(guān)重要，表觀遺傳是影響胎盤發(fā)生及功能維持中的重要因素之一。絕大多數(shù)印記基因在胎盤中表達(dá)，印記基因的缺失或異常激活均可影響胎盤的形態(tài)及功能，導(dǎo)致多種妊娠并發(fā)癥的發(fā)生。本研究檢測了NDFMS和正常胎盤組織中人類已經(jīng)確認(rèn)的95個印記基因的表達(dá)水平，并通過體外細(xì)胞模型對NDFMS中差異表達(dá)的印記基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，明確其在NDFMS發(fā)生中

3、的表觀遺傳機(jī)制，為尋求更有效的診斷和治療方法提供新的思路。本研究分為三個部分：
　　第一部分：NDFMS和正常對照胎盤中印記基因的表達(dá)。
　　目的：印記基因在胎盤及胎兒的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)異常將導(dǎo)致多種妊娠并發(fā)癥的發(fā)生，但印記基因的表達(dá)異常是否參與NDFMS發(fā)生尚不清楚。
　　方法：采用兩階段人群病例-對照研究，首先通過qRT-PCR的方法對10例NDFMS和10例正常對照胎盤組織中人類所有已經(jīng)確認(rèn)的95個

4、印記基因的表達(dá)進(jìn)行初篩，并進(jìn)一步在20例NDFMS和20例正常對照胎盤中驗(yàn)證初篩的差異表達(dá)印記基因。
　　結(jié)果：人類已確認(rèn)的95個印記基因中，79個在胎盤中有表達(dá)，其中22個印記基因差異表達(dá)。通過進(jìn)一步驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)在表達(dá)上調(diào)的印記基因中(DLGAP2、H19、IGF2、KCNQ1DN、SGK2)，H19、KCNQ1DN為母系表達(dá)印記基因，其余為父系表達(dá)印記基因;而下調(diào)的印記基因WTI為父系印記基因。
　　結(jié)論：通過對NDF

5、MS和正常對照胎盤組織的95個印記基因的檢測，發(fā)現(xiàn)6個印記基因在NDFMS組中表達(dá)異常，為后續(xù)的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。
　　第二部分：IGF2及其內(nèi)部miRNA在NDFMS中相互調(diào)控關(guān)系及作用機(jī)制。
　　目的：內(nèi)含子miRNA可能通過靶向宿主基因上游的轉(zhuǎn)錄體系，調(diào)控宿主基因的表達(dá)，或者靶向宿主基因下游功能相關(guān)的基因，從而與宿主基因發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用。IGF2是一種調(diào)控細(xì)胞增殖的生長因子，在胚胎發(fā)育期呈高豐度表達(dá)，對胎盤和胎兒

6、生長發(fā)育有重要的調(diào)控作用。人類IGF2基因的第二內(nèi)含子區(qū)域編碼產(chǎn)生兩條miRNA，即miR-483-5p、miR-483-3p。本節(jié)研究IGF2及內(nèi)部miRNAs在NDFMS中相互調(diào)控關(guān)系及作用機(jī)制。
　　方法：采用qRT-PCR技術(shù)檢測miRNA及mRNA在胎盤中的表達(dá);應(yīng)用焦磷酸測序的方法檢測mir-483基因啟動子區(qū)的甲基化水平;通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)使細(xì)胞的miRNA或基因異常表達(dá);應(yīng)用Transwell試驗(yàn)、CCK-8試驗(yàn)和流

7、式細(xì)胞技術(shù)評價細(xì)胞功能;采用生物信息學(xué)軟件TargetScan、PicTar及DIANA LAB等預(yù)測miRNA的潛在靶基因;Western blot技術(shù)檢測靶基因的蛋白表達(dá)水平;通過雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)體外驗(yàn)證miRNA及其靶基因的結(jié)合關(guān)系。
　　結(jié)果：⑴IGF2內(nèi)部編碼的miR-483-5p、miR-483-3p在NDFMS組中均呈顯著高表達(dá)。NDFMS組中mir-483基因啟動子區(qū)CpG2和CpG6低甲基化是導(dǎo)致miR-4

8、83-5p和miR-483-3p表達(dá)上調(diào)的一個重要機(jī)制;⑵通過轉(zhuǎn)染IGF2質(zhì)粒，使HTR-8/SVneo細(xì)胞過表達(dá)IGF2，其內(nèi)部編碼的miR-483-5p、miR-483-3p的表達(dá)亦顯著升高。IGF2過表達(dá)可促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖和遷移，干擾IGF2后，細(xì)胞增殖受到抑制，而細(xì)胞凋亡和周期沒有受到影響;⑶miR-483-5p通過增加IGF2 P0轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移;⑷過表達(dá)miR-483-3p后未發(fā)現(xiàn)IGF2

9、mRNA的表達(dá)水平發(fā)生改變。miR-483-3p可通過抑制RB1CC1表達(dá)而增加滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo的增殖，參與NDFMS的發(fā)生。
　　結(jié)論：IGF2內(nèi)含子產(chǎn)生的miR-483-5p、miR-483-3p通過不同的機(jī)制協(xié)同其宿主基因IGF2，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和增殖。這種內(nèi)含子miRNAs與宿主基因共同表達(dá)，并發(fā)揮相似生物學(xué)功能的作用模式，為NDFMS發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。
　　第三部分：H19及其內(nèi)部m

10、iRNA在NDFMS中相互調(diào)控關(guān)系及作用機(jī)制。
　　目的：印記基因H19是最早發(fā)現(xiàn)的印記基因之一，為父系沉默，母系表達(dá)。在人胎盤及胚胎組織中表達(dá)較為豐富。H19的異常表達(dá)與流產(chǎn)、子癇前期、胎兒生長受限等妊娠并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。H19可通過第一外顯子編碼的miR-675發(fā)揮功能作用。本節(jié)研究H19及內(nèi)部miR-675在NDFMS中相互調(diào)控關(guān)系及作用機(jī)制。
　　方法：通過qRT-PCR技術(shù)檢測miR-675-5p、miR-67

11、5-3p在NDFMS和正常對照胎盤組織的表達(dá)，并在體外滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo中干擾H19的表達(dá)，以及過表達(dá)或抑制miR-675，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用Transwell試驗(yàn)、CCK-8試驗(yàn)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測 HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖、凋亡、周期和遷移能力。
　　結(jié)果：⑴NDFMS組胎盤miR-675-5p表達(dá)顯著高于對照組，而miR-675-3p的表達(dá)與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;⑵H19可直接影響miR-675-5p、mi

12、R-675-3p的形成，而過表達(dá)miR-675-5p、miR-675-3p后，H19表達(dá)無明顯變化;⑶miR-675-5p與宿主基因H19都可調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖，提示二者協(xié)同參與NDFMS的發(fā)生。
　　結(jié)論：印記基因H19通過調(diào)控其內(nèi)部編碼的miR-675表達(dá)而促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo的增殖，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞增殖紊亂，參與NDFMS的發(fā)生。這種H19-miR-675共同表達(dá)并發(fā)揮相似的生物學(xué)功能的模式，為H19調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)