腎小管上皮細(xì)胞中Cdc42相關(guān)蛋白4對(duì)E-cadherin和Occ ludin表達(dá)的影響及調(diào)節(jié).pdf

1、腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease,CKD)進(jìn)展到終末期所發(fā)生的不可避免的結(jié)果。腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)被認(rèn)為是其中重要的事件之一,在 EMT的過(guò)程中,上皮標(biāo)志物如E-鈣粘蛋白(E-cadherin),閉合蛋白(occludin)等表達(dá)下降,甚至丟失。E-cadherin主要與β-連環(huán)素(β-catenin)一起形成細(xì)胞粘附復(fù)合體,介導(dǎo)細(xì)胞之間的粘附,β-catenin是重要的

2、E-cadherin表達(dá)調(diào)節(jié)分子,其入核后可激活抑制E-cadherin表達(dá)相關(guān)基因的啟動(dòng)子(如Snail,Slug等);occludin則為細(xì)胞緊密連接的重要組成蛋白,介導(dǎo)細(xì)胞之間的緊密連接,維持上皮細(xì)胞的極性,其表達(dá)可以通過(guò)極性蛋白 Par6來(lái)調(diào)節(jié)。有研究表明,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta1(TGF-β1)是重要的促纖維化因子,可通過(guò)經(jīng)典的Smad信號(hào)通路和其他非 Smad信號(hào)通路(包括 MAPK,PI3K/Akt,ERK,RhoGTPa

3、se等)來(lái)完成其對(duì)腎間質(zhì)纖維化的調(diào)節(jié)作用。本文研究的目的蛋白 Cdc42相關(guān)蛋白(Cdc42-interacting protein,CIP4)是 RhoGTPase蛋白家族成員之一,是 Cdc42的下游效應(yīng)蛋白,參與細(xì)胞骨架蛋白肌動(dòng)蛋白(actin)的調(diào)節(jié),對(duì)維持細(xì)胞正常的形態(tài)起重要的作用。我們的研究結(jié)果表明:無(wú)論在大鼠5/6腎切除模型還是小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎(Unilateral ureteral obstruction, UUO)的

4、模型中,與假手術(shù)組相比較,CIP4的表達(dá)均上調(diào),且主要分布在腎小管側(cè)基底膜,細(xì)胞之間的連接處,而E-cadherin和occludin的表達(dá)則下降。體外實(shí)驗(yàn)我們使用TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞作為主要研究對(duì)象,CIP4的表達(dá)同樣上升,并伴隨有 E-cadherin和occludin表達(dá)的下調(diào),與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在無(wú) TGF-β1的刺激下單獨(dú)高表達(dá) CIP4,亦可出現(xiàn)上述相關(guān)蛋白的變化。同時(shí)我們還觀察到,無(wú)論是在TGF-β1的誘導(dǎo)下

5、還是 CIP4高表達(dá)情況下,β-catenin與 CIP4均存在相互作用,但是細(xì)胞總蛋白中β-catenin的表達(dá)無(wú)明顯變化,在核蛋白中的表達(dá)則增加。使用特異性siRNA敲除 CIP4后,核蛋白內(nèi)β-catenin表達(dá)減少,同時(shí) E-cadherin表達(dá)恢復(fù),甚至高于對(duì)照組的表達(dá)水平。進(jìn)一步的研究表明,在高表達(dá) CIP4的情況下特異性敲除β-catenin,E-cadherin的表達(dá)并無(wú)明顯的變化。另一方面,在 TGF-β1誘導(dǎo)和CIP

6、4高表達(dá)的兩組細(xì)胞中,極性蛋白 Par6(Polarity protein,Par6)表達(dá)無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但這兩組細(xì)胞中均存在 CIP4與 Par6的相互作用,但是在對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)是則未觀察到該現(xiàn)象。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn),CIP4可通過(guò)促進(jìn)β-catenin入核調(diào)節(jié) E-cadherin的表達(dá),同樣,CIP4也可能通過(guò) Par6參與 occludin表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　第一部分腎間質(zhì)纖維化模型中CIP4的表達(dá)與分布
　　目的：

7、探討在 SD大鼠5/6腎切除模型以及Balb/c小鼠UUO模型中CIP4的表達(dá)量的變化與分布。
　　方法：SD大鼠5/6腎切除法建立腎臟纖維化模型,Blab/C小鼠通過(guò)結(jié)扎單側(cè)輸尿管建立腎臟纖維化模型。前者采集各組的血清檢測(cè)肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)值;兩組均根據(jù) Masson染色結(jié)果觀察腎臟組織纖維化程度;用免疫組織化學(xué)染色觀察CIP4在模型組和假手術(shù)組的表達(dá)和分布。Western blotting檢測(cè) E-cadheri

8、n、occludin、β-catenin、Par6和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth nuscke actin,α-SMA)蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：5/6腎切除模型中,手術(shù)組動(dòng)物 Scr,BUN水平高于假手術(shù)組;手術(shù)組 Masson染色顯示腎間質(zhì)明顯纖維化,部分腎小球硬化,腎小管萎縮,小管上皮細(xì)胞脫落,CIP4表達(dá)量上調(diào),主要分布在腎小管上皮細(xì)胞側(cè)基底膜細(xì)胞連接處。UUO模型中,手術(shù)組 Masson染色顯示腎間質(zhì)有較多纖維組

9、織形成,部分腎小管擴(kuò)張,部分腎小管萎縮、上皮細(xì)胞脫落。CIP4表達(dá)也上調(diào),主要分布在腎小管上皮細(xì)胞區(qū)域。兩種動(dòng)物模型westen blotting結(jié)果均顯示,CIP4表達(dá)量增加(分別為假手術(shù)組的3.91倍和3.64倍)伴隨著 E-cadherin及occludin表達(dá)的下降,α-SMA表達(dá)增加(P<0.05),β-catenin和Par6表達(dá)量無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：CIP4在纖維化的組織中表達(dá)明顯增加,且主要分布于腎小管上皮細(xì)胞

10、,提示 CIP4與腎間質(zhì)纖維化關(guān)系密切。
　　第二部分 TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中CIP4的表達(dá)與分布
　　目的：探討大鼠腎小管上皮細(xì)胞(Normal rat kidney52E,NRK52E細(xì)胞)在 TGF-β1誘導(dǎo)下 CIP4蛋白表達(dá)量的變化。
　　方法：NRK52E細(xì)胞在含有 TGF-β1(10ng/ml)的培養(yǎng)液中培育72小時(shí),光學(xué)電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;提取細(xì)胞蛋白,Western blo

11、tting檢測(cè)CIP4、E-cadherin、occludin、β-catenin、Par6以及α-SMA蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：對(duì)照組細(xì)胞呈鋪路石樣外觀,細(xì)胞間連接緊密,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則;模型組細(xì)胞體積變大,形狀不規(guī)則,細(xì)胞間連接松散,間隙變大。Western blotting結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,TGF-β1刺激組的NRK52E細(xì)胞 CIP4表達(dá)上調(diào),為對(duì)照組的1.72倍,同時(shí)α-SMA蛋白表達(dá)也增高,E-cadherin及o

12、ccludin表達(dá)量減少(P<0.05),β-catenin和Par6表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)模型所得到的結(jié)果一致,提示 CIP4參與 TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化進(jìn)程。
　　第三部分 CIP4對(duì) E-cadherin表達(dá)的影響與調(diào)節(jié)
　　目的：探討在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程中,CIP4對(duì)β-catenin核轉(zhuǎn)位的調(diào)控,以及對(duì) E-cadherin表達(dá)的影響。
　　方法：用脂質(zhì)體

13、2000將 pcDNA4.0/CIP4質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至 NRK52E細(xì)胞內(nèi),Western blotting檢測(cè)相關(guān)各蛋白的表達(dá);免疫熒光法檢測(cè) CIP4及β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的共定位,用共聚焦顯微鏡觀察;免疫沉淀法檢測(cè) CIP4與β-catenin的相互作用;用特異性 siRNA敲除相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：在 TGF-β1刺激組中,CIP4和β-catenin在核蛋白中的表達(dá)均增加,分別為對(duì)照組的1.82倍和1.59倍。

14、在共聚焦顯微鏡下觀察,免疫熒光結(jié)果顯示正常組 CIP4與β-catenin主要分布于細(xì)胞膜,且在細(xì)胞膜上存在部分共定位,模型組中,CIP4與β-catenin在細(xì)胞膜上分布減少,細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)增多,細(xì)胞核內(nèi)存在部分共定位現(xiàn)象;同時(shí)用免疫沉淀法檢測(cè),在這兩組細(xì)胞中CIP4和β-catenin均存在著相互作用。在倒置顯微鏡下觀察到,對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,呈鋪路石樣的外觀,細(xì)胞間連接緊密;轉(zhuǎn)染了CIP4質(zhì)粒的細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,連接松散,體積變大

15、,其改變與 TGF-β1刺激后的細(xì)胞相類(lèi)似;而轉(zhuǎn)染了pcDNA4.0空載體的細(xì)胞則未發(fā)生上述改變。單獨(dú)轉(zhuǎn)染CIP4目的基因質(zhì)粒的NRK52E細(xì)胞中,CIP4與α-SMA表達(dá)上調(diào),E-cadherin表達(dá)減少(P<0.05),β-catenin的表達(dá)無(wú)明顯變化。用特異性的siRNA沉默 CIP4的表達(dá)后, CIP4的表達(dá)量只為原來(lái)40％。隨著 CIP4表達(dá)的下降,E-cadherin表達(dá)升高,甚至高于對(duì)照組(P<0.05),同時(shí)β-cat

16、enin的表達(dá)仍無(wú)明顯的變化。NRK52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染 CIP4質(zhì)粒后,核蛋白中CIP4與β-catenin表達(dá)均增加(P<0.05),特異性敲除 CIP4后,CIP4在核蛋白中表達(dá)下降,β-catenin的表達(dá)也下調(diào)(P<0.05)。將β-catenin特異性 siRNA轉(zhuǎn)染至 NRK52E細(xì)胞,β-catenin的表達(dá)量下降為對(duì)照組的65％,E-cadherin與 CIP4表達(dá)量無(wú)明顯改變,在已轉(zhuǎn)染高表達(dá) CIP4質(zhì)粒的細(xì)胞中再轉(zhuǎn)染特異

17、性的β-catenin siRNA,與對(duì)照組相比,只轉(zhuǎn)染 CIP4質(zhì)粒組的細(xì)胞,E-cadherin表達(dá)隨 CIP4表達(dá)的增高而下降(P<0.05),而在既轉(zhuǎn)染了CIP4質(zhì)粒也轉(zhuǎn)染了β-catenin siRNA的細(xì)胞中, E-cadherin的表達(dá)恢復(fù)至對(duì)照組水平(P<0.05)。
　　結(jié)論：CIP4可通過(guò)促進(jìn)β-catenin入核,從而調(diào)節(jié) E-cadherin的表達(dá)。
　　第四部分 CIP4對(duì) occludin表達(dá)的影

18、響
　　目的：探討 NRK52E細(xì)胞高表達(dá) CIP4后對(duì)緊密連接蛋白 occludin表達(dá)的影響及與極性蛋白 Par6之間的相互作用關(guān)系。
　　方法：用脂質(zhì)體2000將 pcDNA4.0/CIP4質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至 NRK52E細(xì)胞中,Western blotting檢測(cè)相關(guān)各指標(biāo)的變化;用免疫沉淀法檢測(cè) CIP4與 Par6之間的相互作用。
　　結(jié)果：?jiǎn)为?dú)高表達(dá) CIP4,occluidn表達(dá)下降,α-SMA蛋白表達(dá)量上