分子對接方法及HIV整合酶抑制劑的設(shè)計研究.pdf

1、蛋白質(zhì)分子是生命活動的重要物質(zhì)，它與包括自身在內(nèi)的生物分子的相互作用是生命自組織復(fù)雜體系得以正常調(diào)控運轉(zhuǎn)的分子基礎(chǔ)，一直備受生命科學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注，是二十一世紀(jì)生命科學(xué)研究的前沿與熱點。繼人類基因組計劃之后，生命科學(xué)已經(jīng)進入功能基因組時代，以蛋白質(zhì)聚集體間相互作用與識別為核心內(nèi)容的蛋白質(zhì)組學(xué)研究迅速興起，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域，具有舉足輕重的戰(zhàn)略地位。 隨著計算機處理能力的不斷增強，理論模擬方法也得到了迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。

2、采用分子對接方法進行蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)預(yù)測，已成為蛋白質(zhì)聚集體間相互作用和識別研究的有力手段，并可為實驗工作提供有益的理論指導(dǎo)。如何得到更多正確的對接結(jié)構(gòu)，然后如何有效快速地篩選出近天然結(jié)構(gòu)，仍然是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接方法學(xué)所面臨的關(guān)鍵問題和挑戰(zhàn)。所以，本論文的第一部分工作圍繞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接方法學(xué)研究上的兩個主要難點，進行深入的研究和探討。 在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究中，發(fā)現(xiàn)許多蛋白與疾病的發(fā)生和防治相關(guān)，是新藥研發(fā)的理想靶標(biāo)。在

3、艾滋病的病原體人體免疫缺陷病毒(HIV)復(fù)制過程中，有三種酶起著關(guān)鍵作用。其中，整合酶負責(zé)將病毒cDNA整合到宿主細胞的DNA中，而且在人體正常細胞中并無其功能的類似物，是研發(fā)抗HIV藥物的一個非常有意義的靶點。由于整合酶蛋白的溶解度小，全酶的晶體結(jié)構(gòu)一直沒有獲得，而且受整合酶體外抑制劑篩選實驗的限制，使得整合酶靶向藥物設(shè)計進展緩慢，到目前為止還沒有整合酶抑制劑上市。因此，本論文的第二部分工作以HIV整合酶為研究對象，采用計算機輔助藥物

4、設(shè)計方法進行了HIV-1整合酶抑制劑的設(shè)計、改造和虛擬篩選。在此基礎(chǔ)上，為了進一步獲得有活性的HIV-1整合酶抑制劑，積極籌建酶學(xué)測活方法平臺，開展了HIV-1整合酶的表達和純化等生化實驗工作(見論文第三部分)。 本論文主要內(nèi)容包括以下三個部分：1.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接方法的研究發(fā)展了基于結(jié)合位點信息的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子對接方法。本工作在FTDock分子對接程序基礎(chǔ)上，把蛋白質(zhì)的結(jié)合位點信息整合到分子對接幾何采樣的旋轉(zhuǎn)平移過程中。

5、對10個目標(biāo)復(fù)合物的對接預(yù)測結(jié)果顯示，該方法可以獲得更多的近天然結(jié)構(gòu)，而且最優(yōu)對接結(jié)構(gòu)的配體均方根偏差(RMSD)也有明顯的降低。同時，通過多構(gòu)象疊合的方法在分子對接中考慮蛋白質(zhì)復(fù)合物的主鏈柔性，提高了分子對接的效果。 提出了基于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物類型的組合打分函數(shù)。根據(jù)復(fù)合物的界面性質(zhì)，將64個復(fù)合物劃分為四種類型，即蛋白酶/抑制劑、抗原/抗體、其它酶/抑制劑和其它類型復(fù)合物。該打分函數(shù)組合了蛋白質(zhì)復(fù)合物形成過程中的各種能量

6、，包括界面殘基成對偏好性(RP)、去溶劑化自由能(ACE)、靜電相互作用以及范德華相互作用，應(yīng)用多元線性回歸方法來擬合組合函數(shù)的各項權(quán)重。結(jié)果顯示，基于復(fù)合物類型的組合打分函數(shù)明顯地提高了單獨能量項對近天然結(jié)構(gòu)的評價能力，對蛋白酶/抑制劑、抗原/抗體和其它酶/抑制劑復(fù)合物的對接結(jié)果較一些常用的打分函數(shù)的評價能力有明顯的改善和提高。 2.HIV-1整合酶抑制劑的設(shè)計研究對一類具有較高活性和特異性的整合酶抑制劑——苯乙烯基喹啉類衍生

7、物(SQLs)進行三維定量構(gòu)效關(guān)系(3D-QSAR)及其與整合酶的結(jié)合模式研究，并進行了合理的結(jié)構(gòu)改造。采用了比較分子場分析方法(CoMFA)，得到了一組能夠較好預(yù)測SQLs抑制活性的CoMFA模型，并給出了影響這類化合物生物活性的相關(guān)結(jié)構(gòu)信息。對接結(jié)果顯示，SQLs的喹啉環(huán)上7-位羧基和8-位羥基與靶酶活性區(qū)域中鎂離子形成鰲合作用；預(yù)測的結(jié)合能與抑制劑的活性也有很好的線性關(guān)系。基于上述結(jié)果，采用從頭藥物設(shè)計方法對該類抑制劑進行了合理的

8、結(jié)構(gòu)改造和設(shè)計，并進行分子對接模擬和聚類分析，獲得了在已知SQLs中沒有的4類新化合物結(jié)構(gòu)。 同時，運用計算機模擬方法對界面多肽抑制劑進行了突變設(shè)計研究?；谡厦付垠w的模建結(jié)構(gòu)，采用分子動力學(xué)模擬方法分析二聚體間的相互作用，提取界面肽段與整合酶單體的作用信息。基于界面多肽抑制劑(α1和α5螺旋)進行虛擬殘基突變，并對設(shè)計的多肽分子的二級結(jié)構(gòu)以及其與整合酶單體的作用模式進行預(yù)測。結(jié)果顯示，與α1和α5的螺旋性和結(jié)合能相比，部分

9、設(shè)計的多肽分子的螺旋性和結(jié)合能有明顯改進。 另外，還進行了數(shù)據(jù)庫虛擬篩選，用來尋找新的整合酶抑制劑。在篩選中，基于整合酶核心結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)，采用DOCK4.0程序，對ACD、MDDR、NCI小分子數(shù)據(jù)庫(約258萬個化合物)和中國草藥數(shù)據(jù)庫(約1萬個化合物)進行計算機虛擬篩選。對篩選出來的小分子進行聚類分析和類藥性評價，提出可能有抑制整合酶活性的化合物結(jié)構(gòu)。最后，選取了打分排序和類藥性較好的7個化合物分子并委托公司進行合成，相

10、關(guān)的抗整合酶活性和抗病毒活性的實驗正在進行中。 3.HIV-1整合酶的表達和純化研究為了建立整合酶酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)并進行體外抑制劑的篩選，完成了HIV-1整合酶的表達和純化工作。本論文以HIV-1B亞型國際標(biāo)準(zhǔn)株pol基因為模板克隆出整合酶基因，將其插入pET28a(+)原核表達載體。通過重疊PCR方法對第185位苯丙氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔瑯?gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a(+)/IN(F185K)，在體外大腸桿菌表達系統(tǒng)中以包

11、涵體形式表達整合酶。通過對包涵體變性后，利用鈷離子親和層析柱純化，獲得了純度達85％以上的整合酶蛋白。對整合酶進行復(fù)性，采用ELISA實驗檢驗復(fù)性后的整合酶蛋白具有3’-末端鏈和鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性。通過本實驗工作的進行，構(gòu)建以蛋白為靶點的抑制劑篩選研究平臺，為將理論設(shè)計與實驗檢驗相結(jié)合進行整合酶抑制劑的篩選工作奠定了良好的基礎(chǔ)。同時，通過本實驗工作的進行，構(gòu)建以蛋白為靶點的抑制劑篩選研究平臺，為將理論設(shè)計與實驗檢驗相結(jié)合進行整合酶抑制劑的篩