HSP47siRNA對TGF-β1促進人眼Tenon’s囊成纖維細胞增殖和膠原合成的影響.pdf

1、目的:
　　利用轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1 TGF-β1)促進人眼Tenon's囊成纖維細胞(Human Tenon's capsulefibroblasts，HTCF)增殖和細胞膠原合成模擬青光眼術(shù)后瘢痕形成，觀察HSP47 siRNA重組質(zhì)粒對TGF-β1促進成纖維細胞增殖的影響以及轉(zhuǎn)染后細胞膠原纖維合成的變化，探討RNA干擾技術(shù)特異的沉默HSP47基因是否能成為對抗青光眼濾

2、過手術(shù)后瘢痕形成的新手段。
　　方法:
　　1.人眼Tenon's囊成纖維細胞的體外培養(yǎng)及鑒定:在青光眼濾過手術(shù)術(shù)中取病人的Tenon's囊組織，采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進行人眼Tenon's成纖維細胞的原代培養(yǎng)，當細胞生長至80-90％融合時，對其進行傳代培養(yǎng)。進一步對細胞進行免疫細胞化學染色鑒定，予以波形蛋白(Vimentin)及角蛋白(Kevatin)的染色，鑒定所培養(yǎng)細胞是否為成纖維細胞。
　　2.HSP47siR

3、NA表達載體的構(gòu)建及鑒定:針對HSP47基因設計siRNA序列，克隆到空載體psiRNA-hH1-neo G2載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆行PCR鑒定，擴增提取質(zhì)粒，進一步行酶切鑒定和測序分析。
　　3.CCK8法檢測HSP47 siRNA重組質(zhì)粒對TGF-β1促進人眼Tenon's囊成纖維細增殖活性的影響:試驗分組為:①正常細胞組;②psiRNA-hH1-neoG2-HSP47目的質(zhì)粒+TGF-β1(5ng/ml)組;③

4、TGF-β1(5ng/ml)組;④空載體+TGF-β1(5ng/ml)組;⑤空白對照組:僅含培養(yǎng)基但無細胞組;在LipofectamineTM2000的介導下瞬時轉(zhuǎn)染細胞，分別在細胞轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h進行CCK8細胞活性檢測，檢測不同作用時間psiRNA-hH1-neoG2-HSP47對TGF-β1促進細胞增殖的影響，對各組細胞在450nm吸光度處A值進行比較和統(tǒng)計分析，對各組的細胞增殖活性進行計算并繪制條形圖。
　　4

5、.苦味酸-天狼星紅染色后檢測細胞的膠原變化:將細胞接種于6孔板內(nèi)，試驗分組為:①正常細胞組;②psiRNA-hH1-neo G2-HSP47目的質(zhì)粒+TGF-β1(5ng/ml)組;③TGF-β1(5ng/ml)組;④空載體+TGF-β1(5ng/ml)組;分組進行轉(zhuǎn)染后在72h進行細胞固定，進一步行苦味酸-天狼星紅染色，染色后在偏振光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后細胞內(nèi)Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的變化并照相，進一步軟件分析測定轉(zhuǎn)染前后及TGF-β1刺激

6、細胞后細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量的變化，并行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:
　　1.人眼Tenon's囊成纖維細胞采用組織塊貼壁培養(yǎng)法在體外培養(yǎng)，培養(yǎng)方法簡單容易，細胞在體外生長仍然活躍，細胞傳代培養(yǎng)后生物學性狀與體內(nèi)基本一致，對所培養(yǎng)的細胞行免疫細胞化學染色鑒定，Vimentin抗體為染色陽性（胞漿呈棕黃色顆粒），kevatin染色為陰性，結(jié)果說明體外培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞。
　　2.體外構(gòu)建HSP47-siRNA即psiR

7、NA-hH1-neo G2-HSP47后，行雙酶切鑒定得到大小為2500kb的載體片段和500bp左右的目的片段;測序分析結(jié)果與設計序列相一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　3.CCK8法檢測示HSP47 siRNA重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染同時受TGF-β1刺激的人眼Tenon's囊成纖維細胞后，TGF-β1對細胞增殖的促進作用會受一定的影響，細胞的增殖活性會下降。成纖維細胞經(jīng)psiRNA-hH1-neo G2-HSP47的轉(zhuǎn)染和TGF-β

8、1(5ng/ml)的刺激在24h后細胞的A值及細胞增殖活性就開始出現(xiàn)差異，除空載體+TGF-β1(5ng/ml)組和TGF-β1(5ng/ml)組的細胞A值比較在24h、48h、72h差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其余各組在同一時間段的細胞A值對比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且psiRNA-hH1-neo G2-HSP47目的質(zhì)粒+TGF-β1(5ng/ml)組3個時間點的細胞A值均低于正常細胞組，與TGF-β1(5ng

9、/ml)組相比差異更具有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01);各組組內(nèi)與24h對比結(jié)果顯示psiRNA-hH1-neoG2-HSP47目的質(zhì)粒與TGF-β1作用48h及72h對人眼Tenon's囊成纖維細胞的增殖影響更顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.苦味酸-天狼星紅染色法對各組細胞染色后，偏振光顯微鏡下見經(jīng)TGF-β1誘導后即TGF-β1(5ng/ml)組的細胞中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白密度明顯增高，鏡下膠原纖維的排列變密集

10、且各色折光均明顯增強，與正常細胞組及psiRNA-hH1-neo G2-HSP47目的質(zhì)粒+TGF-β1(5ng/ml)組相比均有差異，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); psiRNA-hH1-neo G2-HSP47重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量均明顯下降，纖維排列疏松，折光減弱，與空載體+TGF-β1(5ng/ml)組、TGF-β1(5ng/ml)組的差異具有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01);空載體+TGF-β1(5n

11、g/ml)組與TGF-β1(5ng/ml)組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.人眼Tenon's囊成纖維細胞在體外培養(yǎng)方法容易，在體外增殖活躍，傳代后細胞生長迅速，生物性狀穩(wěn)定，可作為目前青光眼濾過手術(shù)后局部纖維化研究的理想載體。
　　2.利用TGF-β1能有效促進人眼Tenon's囊成纖維細胞增殖以及細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白合成增加，可模擬青光眼濾過手術(shù)后瘢痕形成時局部纖維化機制，為進一步動

12、物試驗提供依據(jù)。
　　3.利用化學合成的siRNA與psiRNA-hH1-neo G2載體連接，成功的構(gòu)建了靶向HSP47基因的重組質(zhì)粒，方法相對容易，可采用此方法將RNA干擾技術(shù)更好的用于臨床治療。
　　4.HSP47-siRNA能有效地抑制TGF-β1促進的人Tenon's囊成纖維細胞增殖，轉(zhuǎn)染后可使細胞的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白合成減少，說明HSP47與TGF-β1在表達上具有同步性，利用RNA干擾技術(shù)影響HSP47基因的表