HSP47siRNA對(duì)TGF-β1促進(jìn)人眼Tenon’s囊成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響.pdf

1、目的:
　　利用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1 TGF-β1)促進(jìn)人眼Tenon's囊成纖維細(xì)胞(Human Tenon's capsulefibroblasts，HTCF)增殖和細(xì)胞膠原合成模擬青光眼術(shù)后瘢痕形成，觀察HSP47 siRNA重組質(zhì)粒對(duì)TGF-β1促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的影響以及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞膠原纖維合成的變化，探討RNA干擾技術(shù)特異的沉默HSP47基因是否能成為對(duì)抗青光眼濾

2、過(guò)手術(shù)后瘢痕形成的新手段。
　　方法:
　　1.人眼Tenon's囊成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定:在青光眼濾過(guò)手術(shù)術(shù)中取病人的Tenon's囊組織，采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行人眼Tenon's成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％融合時(shí)，對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，予以波形蛋白(Vimentin)及角蛋白(Kevatin)的染色，鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞是否為成纖維細(xì)胞。
　　2.HSP47siR

3、NA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定:針對(duì)HSP47基因設(shè)計(jì)siRNA序列，克隆到空載體psiRNA-hH1-neo G2載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆行PCR鑒定，擴(kuò)增提取質(zhì)粒，進(jìn)一步行酶切鑒定和測(cè)序分析。
　　3.CCK8法檢測(cè)HSP47 siRNA重組質(zhì)粒對(duì)TGF-β1促進(jìn)人眼Tenon's囊成纖維細(xì)增殖活性的影響:試驗(yàn)分組為:①正常細(xì)胞組;②psiRNA-hH1-neoG2-HSP47目的質(zhì)粒+TGF-β1(5ng/ml)組;③

4、TGF-β1(5ng/ml)組;④空載體+TGF-β1(5ng/ml)組;⑤空白對(duì)照組:僅含培養(yǎng)基但無(wú)細(xì)胞組;在LipofectamineTM2000的介導(dǎo)下瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h進(jìn)行CCK8細(xì)胞活性檢測(cè)，檢測(cè)不同作用時(shí)間psiRNA-hH1-neoG2-HSP47對(duì)TGF-β1促進(jìn)細(xì)胞增殖的影響，對(duì)各組細(xì)胞在450nm吸光度處A值進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各組的細(xì)胞增殖活性進(jìn)行計(jì)算并繪制條形圖。
　　4

5、.苦味酸-天狼星紅染色后檢測(cè)細(xì)胞的膠原變化:將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，試驗(yàn)分組為:①正常細(xì)胞組;②psiRNA-hH1-neo G2-HSP47目的質(zhì)粒+TGF-β1(5ng/ml)組;③TGF-β1(5ng/ml)組;④空載體+TGF-β1(5ng/ml)組;分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染后在72h進(jìn)行細(xì)胞固定，進(jìn)一步行苦味酸-天狼星紅染色，染色后在偏振光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的變化并照相，進(jìn)一步軟件分析測(cè)定轉(zhuǎn)染前后及TGF-β1刺激

6、細(xì)胞后細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量的變化，并行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　1.人眼Tenon's囊成纖維細(xì)胞采用組織塊貼壁培養(yǎng)法在體外培養(yǎng)，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單容易，細(xì)胞在體外生長(zhǎng)仍然活躍，細(xì)胞傳代培養(yǎng)后生物學(xué)性狀與體內(nèi)基本一致，對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，Vimentin抗體為染色陽(yáng)性（胞漿呈棕黃色顆粒），kevatin染色為陰性，結(jié)果說(shuō)明體外培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。
　　2.體外構(gòu)建HSP47-siRNA即psiR

7、NA-hH1-neo G2-HSP47后，行雙酶切鑒定得到大小為2500kb的載體片段和500bp左右的目的片段;測(cè)序分析結(jié)果與設(shè)計(jì)序列相一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　3.CCK8法檢測(cè)示HSP47 siRNA重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染同時(shí)受TGF-β1刺激的人眼Tenon's囊成纖維細(xì)胞后，TGF-β1對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用會(huì)受一定的影響，細(xì)胞的增殖活性會(huì)下降。成纖維細(xì)胞經(jīng)psiRNA-hH1-neo G2-HSP47的轉(zhuǎn)染和TGF-β

8、1(5ng/ml)的刺激在24h后細(xì)胞的A值及細(xì)胞增殖活性就開始出現(xiàn)差異，除空載體+TGF-β1(5ng/ml)組和TGF-β1(5ng/ml)組的細(xì)胞A值比較在24h、48h、72h差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余各組在同一時(shí)間段的細(xì)胞A值對(duì)比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且psiRNA-hH1-neo G2-HSP47目的質(zhì)粒+TGF-β1(5ng/ml)組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞A值均低于正常細(xì)胞組，與TGF-β1(5ng

9、/ml)組相比差異更具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);各組組內(nèi)與24h對(duì)比結(jié)果顯示psiRNA-hH1-neoG2-HSP47目的質(zhì)粒與TGF-β1作用48h及72h對(duì)人眼Tenon's囊成纖維細(xì)胞的增殖影響更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.苦味酸-天狼星紅染色法對(duì)各組細(xì)胞染色后，偏振光顯微鏡下見(jiàn)經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后即TGF-β1(5ng/ml)組的細(xì)胞中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白密度明顯增高，鏡下膠原纖維的排列變密集

10、且各色折光均明顯增強(qiáng)，與正常細(xì)胞組及psiRNA-hH1-neo G2-HSP47目的質(zhì)粒+TGF-β1(5ng/ml)組相比均有差異，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); psiRNA-hH1-neo G2-HSP47重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量均明顯下降，纖維排列疏松，折光減弱，與空載體+TGF-β1(5ng/ml)組、TGF-β1(5ng/ml)組的差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);空載體+TGF-β1(5n

11、g/ml)組與TGF-β1(5ng/ml)組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.人眼Tenon's囊成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)方法容易，在體外增殖活躍，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，生物性狀穩(wěn)定，可作為目前青光眼濾過(guò)手術(shù)后局部纖維化研究的理想載體。
　　2.利用TGF-β1能有效促進(jìn)人眼Tenon's囊成纖維細(xì)胞增殖以及細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白合成增加，可模擬青光眼濾過(guò)手術(shù)后瘢痕形成時(shí)局部纖維化機(jī)制，為進(jìn)一步動(dòng)

12、物試驗(yàn)提供依據(jù)。
　　3.利用化學(xué)合成的siRNA與psiRNA-hH1-neo G2載體連接，成功的構(gòu)建了靶向HSP47基因的重組質(zhì)粒，方法相對(duì)容易，可采用此方法將RNA干擾技術(shù)更好的用于臨床治療。
　　4.HSP47-siRNA能有效地抑制TGF-β1促進(jìn)的人Tenon's囊成纖維細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染后可使細(xì)胞的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白合成減少，說(shuō)明HSP47與TGF-β1在表達(dá)上具有同步性，利用RNA干擾技術(shù)影響HSP47基因的表