TNFRSF6B在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡的作用研究.pdf

1、目的:
　　本文通過研究膠質(zhì)瘤組織及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中TNFRSF6B蛋白的表達(dá)情況及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，闡明TNFRSF6B在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義;同時(shí)探討TNFRSF6B對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的作用及潛在分子機(jī)制，為膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷提供生物標(biāo)記物及為分子靶向治療篩選有益的靶點(diǎn)。
　　材料與方法:
　　1.構(gòu)建膠質(zhì)瘤組織微陣列，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法(EnVision法)，檢測(cè)TNFRSF6B蛋白在125例

2、膠質(zhì)瘤組織和18例正常腦組織中的表達(dá)和相對(duì)含量，并分析TNFRSF6B蛋白的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤臨床病理特征、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達(dá)、Ki-67表達(dá)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達(dá)及病人生存的關(guān)系。
　　2.篩選高表達(dá)TNFRSF6B的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系;將TNFRSF6B中和性抗體加入膠質(zhì)瘤細(xì)胞系

3、(U251MG，LN-308，U87MG)中，通過MTS、CellTiter-Blue CellViability Assay、軟瓊脂集落形成及Hoechst33342/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)熒光雙染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度TNFRSF6B中和性抗體作用于不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞后的細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)TNFRSF6B中和性抗體加入后膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的差異;通過FCM、Caspa

4、se-3/7活性檢測(cè)、Hoechst33342/PI熒光雙染等實(shí)驗(yàn)分析TNFRSF6B中和性抗體對(duì)凋亡的影響;并使用western blot對(duì)TNFRSF6B中和性抗體作用后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞存活，凋亡及侵襲相關(guān)的信號(hào)通路蛋白檢測(cè)，包括MMP-2，ERK1/2，AKT等。對(duì)TNFRSF6B在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程的作用以及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞各種生物學(xué)功能的影響進(jìn)行探討，為TNFRSF6B日后的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用

5、SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。腫瘤組織及正常腦組織中TNFRSF6B及GFAP蛋白表達(dá)強(qiáng)度差異使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，陽(yáng)性率差異使用卡方檢驗(yàn);膠質(zhì)瘤中TNFRSF6B及GFAP蛋白表達(dá)強(qiáng)度及表達(dá)率在不同病理分級(jí)中的差異使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn);膠質(zhì)瘤中TNFRSF6B及GFAP蛋白表達(dá)強(qiáng)度在不同年齡、性別組的差異使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，陽(yáng)性

6、率差異使用卡方檢驗(yàn);膠質(zhì)瘤中TNFRSF6B及GFAP蛋白表達(dá)與病理分級(jí)的關(guān)系使用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。Ki-67、PCNA LI等計(jì)量資料的相關(guān)統(tǒng)計(jì)如滿足正態(tài)分布及方差齊性的要求，兩組比較用成組t檢驗(yàn)，包括膠質(zhì)瘤vs正常腦組織;病理分級(jí)Ⅰ-Ⅱ組vsⅢ-Ⅳ組;TNFRSF6B陽(yáng)性組vs陰性組等。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齊時(shí)采用SNK-q檢驗(yàn)(Student-Newman-Keuls)進(jìn)行

7、兩兩間顯著性檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)先變量轉(zhuǎn)換，如仍不齊則用秩和檢驗(yàn)中的H檢驗(yàn)法(Kruskal-Wallis)多組比較用方差分析，如Ki-67、PCNA LI在TNFRSF6B不同表達(dá)組的差異。生存資料用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析，進(jìn)行分組因素水平間的線性趨勢(shì)檢驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，細(xì)胞克隆數(shù)，細(xì)胞周期比例和細(xì)胞凋亡數(shù)量，使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。對(duì)組間的差異進(jìn)行檢測(cè)，使用方差分析(AN

8、OVA)和student t檢驗(yàn)分析有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.TNFRSF6B陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。125例膠質(zhì)瘤組織中，99例標(biāo)本可見不同程度陽(yáng)性表達(dá)，TNFRSF6B的陽(yáng)性表達(dá)率為79.2％;18例正常腦組織中，2例標(biāo)本可見陽(yáng)性表達(dá)，TNFRSF6B的陽(yáng)性表達(dá)率為11.1％。膠質(zhì)瘤中TNFRSF6B的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度率明顯高于正常組織（Z=-4.661，P＜0.001，M

9、ann-Whitney U檢驗(yàn)），表達(dá)率明顯也明顯高于正常組織(x2=24.343，P＜0.001，卡方檢驗(yàn))。TNFRSF6B表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的升高而增高，其中強(qiáng)陽(yáng)性(+++)僅見于Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤病例，Ⅰ～Ⅱ級(jí)與Ⅲ～Ⅳ級(jí)間TNFRSF6B差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=36.082，P＜0.001)。其中低分級(jí)組（Ⅰ-Ⅱ級(jí)）陽(yáng)性率為55.1％（27/49），高分級(jí)組（Ⅲ-Ⅳ級(jí)）陽(yáng)性率為94.7％(72/76)。采用Spearman等級(jí)相

10、關(guān)法分析顯示，TNFRSF6B蛋白表達(dá)水平與病理分級(jí)呈正相關(guān)(rs=0.614，P＜0.01)。但TNFRSF6B表達(dá)與性別及年齡無明顯相關(guān)，P＞0.05。
　　2.正常腦組織中Ki-67標(biāo)記指數(shù)(labeling index，LI)為0.08±0.04，明顯低于膠質(zhì)瘤組織的12.47±1.16（t=10.71，P＜0.001）;正常腦組織中PCNA LI為0.03±0.02，明顯低于膠質(zhì)瘤組織的10.86±1.01(t=10.6

11、9，P＜0.001)。膠質(zhì)瘤組織中Ki-67 LI為12.47±1.16，明顯高于PCNA LI的10.86±1.01（t=5.985，P＜0.01）。 Ki-67與PCNA LI呈正相關(guān)(rs=0.978，P＜0.01)。Ki-67及PCNA LI隨膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的增高而增高。 Ki-67 LI與病理分級(jí)呈正相關(guān)（rs=0.851，P＜0.01）;同樣，PCNA LI與病理分級(jí)也呈正相關(guān)(rs=0.851，P＜0.01)。Ki-67和

12、PCNA LI與性別、年齡均無關(guān)。TNFRSF6B陰性組Ki-67 LI表達(dá)量為3.29±1.04，明顯低于TNFRSF6B陽(yáng)性組的15.09±1.34（t=6.96，P＜0.001）;TNFRSF6B陰性組PCNA LI表達(dá)量為2.78±0.89，也明顯低于TNFRSF6B陽(yáng)性組的13.17±1.17（t=7.06，P＜0.001）。Ki-67 L1與TNFRSF6B表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.459，P＜0.01）;PCNA L1與TN

13、FRSF6B表達(dá)亦呈正相關(guān)(rs=0.477，P＜0.01)。
　　3.GFAP蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(rs=0.632，P＜0.01)。正常腦GFAP蛋白表達(dá)率為100.0％，與Ⅰ-Ⅱ級(jí)(81.6％)和Ⅲ-Ⅳ級(jí)(39.7％)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Ⅰ-Ⅱ級(jí)與Ⅲ-Ⅳ級(jí)之間GFAP蛋白表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中Ⅳ級(jí)的表達(dá)率最低，為25.0％。TNFRSF6B與GFAP蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(

14、rs=-0.397，P＜0.01)。GFAP的蛋白表達(dá)與Ki-67(rs=-0.465，P＜0.01)及PCNA LI（rs=-0.483，P＜0.01）均呈負(fù)相關(guān)。
　　4.本研究中76例患者具有完整生存期資料。Ki-67與PCNA的表達(dá)與生存期密切相關(guān)，證明該生存期資料的可靠性。檢測(cè)76例TNFRSF6B表達(dá)與患者生存期的關(guān)系發(fā)現(xiàn)TNFRSF6B陰性組生存期為50±1.79個(gè)月，略高于TNFRSF6B陽(yáng)性組的47.45±3.1

15、1個(gè)月，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　5.使用MTS法測(cè)定抗TNFRSF6B中和性抗體的細(xì)胞增殖抑制效果結(jié)果顯示，在加入無關(guān)抗體hIgG1處理的所有3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中細(xì)胞增殖沒有受到任何影響。另外兩種細(xì)胞系的LN-308和U87MG中，TNFRSF6B中和性抗體對(duì)細(xì)胞周期也有類似影響，但影響稍弱。
　　6.使用TNFRSF6B中和性抗體處理后，caspase-3/7的活性在測(cè)試的所有3種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系凋亡都明

16、顯增強(qiáng)，并表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性。該結(jié)果與細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果相吻合，TNFRSF6B中和性抗體對(duì)caspase-3/7活性的影響最顯著的是U251MG細(xì)胞，最適濃度為0.8mg/L，活性最高時(shí)間點(diǎn)是TNFRSF6B中和性抗體處理后96小時(shí)。同時(shí)使用Hoechst33342/PI雙熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TNFRSF6B中和性抗體處理組的凋亡明顯增加，結(jié)果與caspase-3/7活性檢測(cè)相符。
　　7.最后，我們通過使用免疫印跡檢查了與細(xì)胞

17、存活增殖，凋亡，侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的MMP-2，ERK1/2和AKT的表達(dá)量。無關(guān)抗體hIgG1對(duì)這些通路的影響不大。但MMP-2，磷酸化ERK1/2和磷酸化-AKT的表達(dá)量在經(jīng)過TNFRSF6B中和性抗體處理96小時(shí)后下降明顯。
　　結(jié)論:
　　1.TNFRSF6B與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)及GFAP表達(dá)、細(xì)胞增殖狀態(tài)有關(guān)，提示在膠質(zhì)瘤的發(fā)生，發(fā)展過程中，TNFRSF6B的異常表達(dá)發(fā)揮重要的作用。
　　2.TNFRSF6B的高表