人mda-7-IL-24及其剪接變異體mda-7-IL-24as1對(duì)惡性造血腫瘤細(xì)胞的促分化作用的研究.pdf

1、黑色素瘤分化相關(guān)基因-7(mda-7，又稱1L-24)是1995年采用減數(shù)雜交技術(shù)在誘導(dǎo)終末分化的人黑色素瘤細(xì)胞HO-1中發(fā)現(xiàn)的新基因。mda-7/IL-24在很多實(shí)體腫瘤(包括黑色素瘤、前列腺癌、宮頸癌、小細(xì)胞肺癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等)中異位表達(dá)時(shí)具有腫瘤細(xì)胞特異性抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡作用：此外，還可以抑制腫瘤血管新生、具有抗腫瘤“旁觀者效應(yīng)”以及能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)射線的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)mda-7/IL-24在實(shí)體瘤中的抗腫瘤作用機(jī)制

2、是多種多樣的，而對(duì)造血系統(tǒng)惡性腫瘤的作用還不清楚。我們?cè)谇捌诠ぷ髦?，在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞系【J937、HL60向單核一巨噬細(xì)胞分化后發(fā)現(xiàn)有mda-7/IL-24及mda-7/IL-24選擇性剪接體IL-24asl的表達(dá)。mda-7/IL-24及IL-24asl在HL-60、U937白血病中的作用，與白血病細(xì)胞分化的關(guān)系尚無文獻(xiàn)報(bào)道。 為了探索mda-7/IL-24、IL-24asl以及二者同時(shí)存在情況下對(duì)HL-60、U937的作用，

3、我們構(gòu)建了mda-7/IL-24、剪接體IL-24asl、IL-24和IL-24asl共表達(dá)的真核表達(dá)載體plRES-IL-24、plRES-IL-24asl、plRES-IL-24-IL-24asl，通過電穿孔法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人白血病細(xì)胞系U937、HL60，經(jīng)confocol和Western blot方法鑒定轉(zhuǎn)染效率及目的基因的表達(dá)情況。通過生長(zhǎng)曲線、集落形成實(shí)驗(yàn)、FACS和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)mda-7/IL-24、剪接體IL-24asl以及

4、IL-24-IL-24asl對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、集落形成能力、凋亡情況、體內(nèi)致瘤性變化的影響來評(píng)價(jià)mda-7/IL-24、IL-24asl、IL-24-IL-24asl對(duì)HL-60、U937的抗腫瘤作用，并且通過形態(tài)學(xué)染色和細(xì)胞表面單核巨噬系分化標(biāo)志分子CD11b、CD14、M-CSFR的檢測(cè)來評(píng)價(jià)其對(duì)單核巨噬系分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h、72 h，HL-60、U937細(xì)胞均出現(xiàn)mda-7/LI-24、I

5、L-24asl、IL-24．IL-24asl蛋白表達(dá)，72 h達(dá)到高峰期。瞬時(shí)表達(dá)mda-7/IL-24、IL-24asl、IL-24-IL-24asl的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞增殖活力以及集落形成能力與對(duì)照組相比明顯下降(p<0.05)，凋亡率與對(duì)照比明顯升高(p<0.05)，其中IL-24asl抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用較強(qiáng)，而IL-24的促凋亡能力較強(qiáng)。裸鼠體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了mda-7/IL-24、IL-24asl、IL-24-IL

6、-24asl的抗腫瘤作用。細(xì)胞分化相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組相比，mda-7/IL-24、IL-24asl、IL-24-IL-24asI具有明顯促進(jìn)U937、HL60向單核巨噬系分化能力(P<0.05)，CD11b、CD4、M-CSFR表達(dá)明顯升高，其中IL-24asl的促分化作用較強(qiáng)。上述結(jié)果表明，mda-7/IL-24、剪接體IL-24asl、IL-24-IL-24asl均有抑制腫瘤生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化成熟的作用，其中剪接體IL-

7、24asl的促分化作用較強(qiáng)，IL-24的促凋亡作用較強(qiáng)。盡管HL-60、U937在用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化后可以同時(shí)出現(xiàn)mda-7/IL-24及IL-24asl的表達(dá)，但將mda-7/IL-24及其剪接體IL-24asl同時(shí)異位轉(zhuǎn)染到白血病細(xì)胞，并不能使抑制生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡、誘導(dǎo)分化作用較單獨(dú)基因轉(zhuǎn)染更強(qiáng)，可能二者之間不存在協(xié)同作用方式。 為了進(jìn)一步證實(shí)mda-7/IL-24、剪接體IL-24asl、IL-24-IL-24asl對(duì)白血病細(xì)

8、胞的誘導(dǎo)分化作用，我們又通過電穿孔方法將特異性針對(duì)于mda-7/IL-24和IL-24asl基因的干擾片斷siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到U937、HL60細(xì)胞系中，同時(shí)加入TPA誘導(dǎo)mda-7/IL-24和IL-24asl的表達(dá)。通過形態(tài)學(xué)染色和檢測(cè)細(xì)胞表面CD11b、CD14、M-CSFR的表達(dá)來評(píng)價(jià)siRNA對(duì)mda-7/IL-24和IL-24asl基因表達(dá)的干擾是否影響誘導(dǎo)劑對(duì)HL-60、U937的誘導(dǎo)分化作用。Western blot測(cè)定

9、干擾效率可達(dá)80％。形態(tài)學(xué)及分化相關(guān)分子表達(dá)均證實(shí)，siRNA干擾mda-7/IL-24以及IL-24asl的表達(dá)，會(huì)使誘導(dǎo)劑失去對(duì)U937、HL60細(xì)胞向單核巨噬系誘導(dǎo)分化作用。以上結(jié)果進(jìn)一步表明mda-7/IL-24和IL-24asl與U937、HL60細(xì)胞的單核巨噬系分化密切相關(guān)。 為了進(jìn)一步檢測(cè)mda-7/IL-24以及IL-24asl能否誘導(dǎo)單核細(xì)胞白血病病人骨髓幼稚細(xì)胞分化和凋亡，我們收集了3例M5型白血病病人骨髓單

10、個(gè)核細(xì)胞，通過電穿孔方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染plRES-IL-24、plRES-IL-24asl以及plRES-IL-24．IL-24asl，72 h后通過FACS檢測(cè)細(xì)胞表面CD11b、CD14、M-CSFR的表達(dá)、凋亡的變化以及進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染plRES-IL-24、plRES-IL-24asl、plRES-IL-24-IL-24asl的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，有明顯的促進(jìn)病人細(xì)胞分化成熟的作用，CD11b、CD14、M

11、-CSFR指標(biāo)各有不同程度的升高。形態(tài)學(xué)染色亦表明IL-24asl、 IL-24、IL-24-IL-24asl具有促病人BMMC向成熟階段分化的作用。凋亡檢測(cè)表明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染plRES-IL-24、plRES-IL-24asl以及plRES-IL-24-IL-24asl對(duì)兩例病人有明顯的促凋亡作用。 我們的工作首次證明，異位表達(dá)的mda-7/IL-24、IL-24asl、IL-24．IL-24asl可抑制造血系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞HL-6