Mda-7-IL-24基因與卵巢癌耐藥細(xì)胞凋亡及耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、卵巢癌是死亡率極高的婦科惡性腫瘤，化療在卵巢癌的治療中有著重要的作用，但對(duì)化療耐藥嚴(yán)重制約著卵巢癌治愈率的提高，對(duì)于如何實(shí)現(xiàn)耐藥逆轉(zhuǎn)、提高化療藥敏感性一直是研究的熱點(diǎn)。mda-7/IL-24基因具有選擇性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子免疫功能雙重作用，在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)具有明顯抗腫瘤作用，應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)該基因在腫瘤基因治療方面有很好的應(yīng)用前景，可能是一個(gè)理想的基因治療功能基因。本研究探討了mda-7/IL-24基因轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞

2、的凋亡誘導(dǎo)和耐藥性影響，了解該基因?qū)β殉舶┠退幖?xì)胞的抗腫瘤作用，以尋求能逆轉(zhuǎn)耐藥的途經(jīng)，為實(shí)現(xiàn)臨床卵巢癌基因治療提供基礎(chǔ)研究。 方法：利用Adeasy 1系統(tǒng)，從質(zhì)粒pREP4-mda-7構(gòu)建并鑒定人mda-7/IL-24基因重組腺病毒Ad．mda-7/IL-24，用構(gòu)建的Ad．mda-7/IL-24感染卵巢癌耐藥細(xì)胞株OVCAR-3，OVCAR-8和配對(duì)的A2780、A2780/DDP，了解mda-7/IL-24基因?qū)β殉舶┠?/p>

3、藥細(xì)胞的抗腫瘤作用，以及對(duì)它們生長和耐藥性的影響。本研究分成三部分： 1．構(gòu)建Ad-mda-7/IL-24：從質(zhì)粒pREP4-mda-7中擴(kuò)增目的基因mda-7/IL-24，亞克隆至pAdTrack CMV穿梭質(zhì)粒中，與pAdEasy 1質(zhì)粒在E.coli BJ5183中進(jìn)行同源重組為腺病毒載體質(zhì)粒，線形化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝擴(kuò)增得到Ad.mda-7/IL-24并鑒定。 2.Ad.mda-7/IL-24感染及凋亡誘導(dǎo)

4、：感染人卵巢癌泰素耐藥株OVCAR-8，RT--PCR法檢測感染后mda-7/IL-24mRNA表達(dá)情況，Westem-blot檢測感染后MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)。感染OVCAR-3，OVCAR-8細(xì)胞，用Hoechst33258凋亡染色和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期改變。 3.Ad.mda-7/IL-24感染對(duì)卵巢癌細(xì)胞株生長及耐藥影響：MTT法檢測OVCAR-3，OVCAR-8細(xì)胞感染Ad.mda-7/IL-24

5、后生長情況，以及OVCAR-3，0VCAR-8，A2780、 A2780/DDP四種細(xì)胞感染后對(duì)DDP，ADM，5-FU，Taxol四種化療藥物敏感性的變化。 結(jié)果： 1.重組腺病毒Ad.mda-7/IL-24經(jīng)測序、酶切電泳表明構(gòu)建成功，Ad.mda-7/IL-24病毒感染量為10＃L時(shí)，感染OVCAR-8和OVCAR-3細(xì)胞可達(dá)100％轉(zhuǎn)染率。 2.Ad.mda-7/IL-24感染OVCAR-8細(xì)胞后，細(xì)胞m

6、da-7/IL-24mRNA表達(dá)明顯增高，未感染組和感染Ad.GFP組沒有表達(dá)上的變化；感染24h后，MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)明顯，感染后48h和72h后，蛋白表達(dá)量明顯增加，感染Ad.GFP及未感染組均未見蛋白表達(dá)。OVCAR-3和OVCAR-8兩種細(xì)胞感染Ad.mda-7/IL-24后，隨時(shí)間增加凋亡細(xì)胞逐漸增加，OVCAR-3細(xì)胞感染后48 h和72 h的凋亡指數(shù)與感染Ad.GFP組及未感染組有顯著性差異，OVCAR-8細(xì)胞

7、感染后24h、48h、72h的凋亡指數(shù)均比對(duì)照組高，有顯著性差異，72h內(nèi)OVCAR-3細(xì)胞最高凋亡率為14.1％，OVCAR-8細(xì)胞為32.4％。 3.Ad.mda-7/IL-24感染OVCAR-3，OVCAR-8后細(xì)胞生長抑制明顯，感染后兩種細(xì)胞的泰素藥敏分別提高2.76和1.52倍，OVCAR-3細(xì)胞對(duì)ADM和5-FU藥敏分別提高1.6和3.01倍。Ad.mda-7/IL-24感染.A2780和其順鉑耐藥株A2780/DD

8、P，感染后A2780細(xì)胞對(duì)DDP，5-FU，Taxol三種藥的耐藥性降低，DDP的藥物敏感性提高了15.45倍，5-FU和Taxol的藥物敏感性分別提高了2.15、3.63倍；A2780/DDP細(xì)胞對(duì)5--FU藥敏提高了2.62倍。 結(jié)論：成功構(gòu)建了人mda-7/IL-24重組腺病毒Ad.mda-7/IL-24，并能有效感染卵巢癌耐藥細(xì)胞株轉(zhuǎn)染基因。mda-7/IL-24轉(zhuǎn)染卵巢癌耐藥細(xì)胞后可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并有細(xì)胞有生長抑制