SLP76各結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點的功能性研究.pdf

1、實驗室早期的工作是運用T7噬菌體展示技術(shù)從人肺的cDNA文庫中篩選到與晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)胞內(nèi)段作用的蛋白12種，含有SH2結(jié)構(gòu)域的76 kDa的白細胞蛋白(SLP76)是其中一種。SLP76與RAGE的體內(nèi)、體外結(jié)合實驗均證實二者之間存在相互作用。同時我們證實這種相互作用存在刺激依賴性。
　　SLP76是血源性細胞所特有的一種接頭蛋白，其在T細胞受體相關(guān)信號通路及凝血功能方面起到重要作用，在細胞中SLP76可以和多種

2、蛋白相互作用，并參與多條信號轉(zhuǎn)導通路。SLP76的結(jié)構(gòu)包括氨基末端的SAM結(jié)構(gòu)域、羧基末端的SH2結(jié)構(gòu)域和位于二者之間的富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域及多個磷酸化位點。
　　晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子在氧化環(huán)境里的一種還原糖共價加成物。特別在生物大分子循環(huán)代謝速率減慢（如衰老）和一些易造成氧化應激的疾?。ㄈ缣悄虿?、動脈粥樣硬化等）過程中生成增多。與其他受體介導AGEs清除不同的是，RAGE與AGEs結(jié)合后可

3、激活細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導通路，進而發(fā)揮其病理生理功能。
　　研究表明SLP76或RAGE與不同的配體結(jié)合都可以導致核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化。因此我們可以提出如下假設(shè):當RAGE與其配體相互作用后，RAGE胞內(nèi)段通過與由SLP76參與的接頭蛋白復合體相互作用，再由復合體中的Grb2將信號傳遞給Ras，Ras可以激活下游的絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶Raf，信號由高度保守的三級激酶模式向下游傳遞，進而觸動細胞內(nèi)的氧化應激并導致NF-κB

4、的活化，使得效應細胞細胞因子表達譜發(fā)生變化，產(chǎn)生相應的生理學和病理學功能。
　　如果上述假設(shè)能夠得到證實，對闡明RAGE和SLP76相互作用在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中的作用具有重要意義，并且能夠以RAGE和SLP76相互作用為切入點揭示RAGE相關(guān)疾病的發(fā)病機制。為此我們構(gòu)建了一系列SLP76的突變體，對SLP76突變體在整個過程中介導的功能進行了初步研究。實驗分幾個階段進行。第一階段，制備AGEs。第二階段，構(gòu)建十種SLP76突變體。

5、第三階段，SLP76突變體對MAPK磷酸化的影響。第四階段，SLP76突變體對自身酪氨酸磷酸化的影響。第五階段，SLP76突變體對RAGE-SLP76相互作用的影響。
　　綜上所述，我們成功制備了具有生物學活性的AGEs;成功構(gòu)建了十種SLP76突變體，且SLP76各突變體在HEK293細胞中均有穩(wěn)定表達;免疫共沉淀實驗初步確定了SLP76與RAGE相互作用的候選結(jié)構(gòu)域及位點，為SAM結(jié)構(gòu)域，第145為酪氨酸，第173位酪氨酸，第