潛在磷酸化位點對AGV2 VP3凋亡功能的影響.pdf

1、新型環(huán)形病毒AGV2最早于2011年被檢測報道。AGV2基因組結構與雞傳染性貧血病毒CAV相似，同樣編碼VP1、VP2和VP3蛋白。與CAV的VP3蛋白類似，AGV2 VP3蛋白也已被證明具有誘導腫瘤細胞凋亡的功能。CAV的VP3蛋白中108位的蘇氨酸等關鍵磷酸化位點已被證明，不僅與VP3在腫瘤細胞的核定位有關，而且與VP3誘導腫瘤細胞功能密切相關。那么在AGV2的VP3蛋白上是否也存在相應的潛在磷酸化位點？這些位點是否對AGV2 VP

2、3蛋白的凋亡功能具有重要影響？為探究AGV2的VP3蛋白中可能的潛在磷酸化位點對AGV2 VP3凋亡功能影響，本研究在預測AGV2 VP3蛋白中4個潛在磷酸化位點的基礎上，進行了真核表達載體的構建，并評價了這4個潛在磷酸化位點對AGV2 VP3凋亡功能影響。
　　一、AGV2 VP3蛋白不同潛在磷酸化位點變體構建
　　為了研究磷酸化位點對AGV2 VP3蛋白的凋亡功能作用，根據CAV的VP3蛋白中已驗證的與凋亡功能相關的磷酸

3、化位點，利用overlap PCR技術將AGV2 VP3基因上的4個潛在磷酸化位點包括61位的蘇氨酸、90位的絲氨酸、91位的絲氨酸以及111位的蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，并克隆獲得了與EGFP蛋白融合的4個AGV2 VP3變體pCEGFP-AGV2VP3T61A、pCEGFP-AGV2 VP3S90A、pCEGFP-AGV2 VP3S91A和pCEGFP-AGV2VP3T111A。通過轉染293T細胞，分別用抗AGV2 VP3抗體以及GFP

4、抗體對4個VP3變體的表達進行了Western Blot分析。結果發(fā)現，四個變體均能很好的表達VP3蛋白。在Western Blot中可見42kD處有特異性條帶。四個潛在磷酸化位點VP3變體的構建及表達為進一步研究磷酸化位點對AGV2 VP3凋亡功能的影響打下了基礎。
　　二、不同潛在磷酸化位點對AGV2 VP3凋亡功能影響
　　為檢測潛在磷酸化位點對AGV2 VP3凋亡功能的影響，將獲得的表達4個潛在磷酸化位點變體的VP3

5、的陽性質粒pCEGFP-AGV2VP3T61A、pCEGFP-AGV2 VP3S90A、pCEGFP-AGV2 VP3S91A和pCEGFP-AGV2 VP3T111A，以及野生型pCEGFP-AGV2 VP3分別轉染人結腸癌細胞HCT116、正常雞胚成纖維細胞CEF以及DF1細胞。通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現，AGV2 VP3及其變體在HCT116以及DF1細胞均定位于細胞核內，且呈散在的點狀分布，類似凋亡小體;而在CEF中在胞漿及胞

6、核均有表達。利用AnnexinV-PE/7-AAD流式細胞術檢測VP3凋亡發(fā)現，pCEGFP-AGV2 VP3T61A、pCEGFP-AGV2VP3S90A、pCEGFP-AGV2 VP3S91A和pCEGFP-AGV2 VP3T111A對HCT116細胞誘導凋亡比率比對照EGFP質粒高10％-20％。在檢測caspase活性時發(fā)現，AGV2 VP3及其各變體的活性值是對照EGFP的1.5倍到2倍。這些結果表明，所檢測的4個潛在磷酸化位