2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  PKCδ(Protein kinase Cδ,PKCδ)在細(xì)胞的生長、分化、凋亡、腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮非常重要的作用,但目前關(guān)于PKCδ在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的具體作用還不十分清楚,關(guān)于PKCδ的激酶生理性作用底物方面的研究也甚少。本研究小組前期工作首次發(fā)現(xiàn)BAG3是PKCδ的磷酸化底物。
  BAG(Bcl-2 associated athanogene,BAG)家族是20世紀(jì)90年代初新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白家族,其成員可以

2、通過“BAG”功能區(qū)與熱休克蛋白(Heat-shockprotein,Hsp)家族成員結(jié)合。BAG3是BAG家族成員之一,與熱休克蛋白Hsp70/Hsc70具有高度親和力,通過作用于Hsp70/Hsc70產(chǎn)生非常廣泛的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng),如抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等。BAG3雖然本身的抗凋亡作用有限,但它能與抗凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合并發(fā)揮協(xié)同作用,拮抗bax和Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。BAG3還可以直接與粘著斑激酶(F

3、ocal adhesion kinase,F(xiàn)AK)相互作用,調(diào)控腫瘤細(xì)胞粘著和遷移;并且BAG3的表達(dá)水平與多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲關(guān)系密切。另外,BAG3還能與磷脂酶C(Phospholipase Cγ,PLCγ)特異結(jié)合,在表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)受體酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物被激活后,BAG3與PLCγ解離,激活Hsp70/Hsc70,參與EGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。BAG3在大部分正常人體組

4、織中表達(dá)很弱或不表達(dá),但在白血病細(xì)胞和許多實(shí)體腫瘤中表達(dá)明顯增加,BAG3的高水平表達(dá)維持腫瘤細(xì)胞的存活,抑制BAG3的表達(dá)可以明顯增加腫瘤細(xì)胞對TRAIL、蛋白酶體抑制劑等化療藥物的反應(yīng)性。這些研究表明,BAG3通過與Bcl-2、Hsp70、PLCγ、 FAK等多種蛋白相互作用,在多個(gè)水平調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、運(yùn)動(dòng)、遷移及侵襲等行為,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及對化療藥物敏感性關(guān)系密切。
  翻譯后修飾使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,功能更

5、為完善,調(diào)節(jié)更為精細(xì),作用更為專一,是基本生命活動(dòng)完成的必須條件。其中,磷酸化是最普遍的翻譯后修飾方式之一。有研究表明BAG3蛋白在細(xì)胞內(nèi)保持基礎(chǔ)水平的磷酸化狀態(tài),在基礎(chǔ)條件下BAG3與PLCγ、 Hsp70/Hsc70相互作用,形成三元復(fù)合物。表皮生長因子信號促進(jìn)BAG3與PLCγ解離,同時(shí)激活Hsp70/Hsc70,增加PLCγ和BAG3蛋白磷酸化水平;而廣譜PKC抑制劑可以降低BAG3基礎(chǔ)水平磷酸化,并且可以抑制EGF誘導(dǎo)的BAG

6、3與PLCγ的解離。PLCγ是磷脂酶C家族的一個(gè)重要成員,在許多腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中PLCγ的表達(dá)升高,并且與腫瘤的增殖、遷移、運(yùn)動(dòng)及侵襲等行為關(guān)系密切。表皮生長因子作為其上游信號分子,通過磷酸化PLCγ參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等行為的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明BAG3蛋白可被磷酸化修飾,并且BAG3的磷酸化修飾可能通過調(diào)控EGF介導(dǎo)的PLCγ活化,參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等行為的調(diào)節(jié)。然而執(zhí)行BAG3磷酸化的具體激酶、磷酸化的具體作

7、用靶點(diǎn)及其功能尚不清楚。前期工作中我們鑒定出BAG3是PKCδ的磷酸化底物,提示PKCδ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能通過磷酸化BAG3,進(jìn)而調(diào)節(jié)其生物學(xué)功能。
  本研究擬論證PKCδ介導(dǎo)BAG3蛋白磷酸化對腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響及其潛在的分子機(jī)制。通過本項(xiàng)目的進(jìn)一步深入解析,將加深我們對BAG3上游調(diào)控信號以及PKCδ生理性激酶作用底物的理解,加深我們對BAG3及PKCδ在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展以及耐藥等方面機(jī)制的理解,對于尋找

8、新的藥物作用靶點(diǎn)和腫瘤標(biāo)志物都具有非常積極的意義和重要參考價(jià)值。
  方法:
  1、培養(yǎng)CHO細(xì)胞,建立WT-PKCδ、DN-PKCδ、CA-PKCδ穩(wěn)定過表達(dá)CHO細(xì)胞系;培養(yǎng)甲狀腺癌FRO細(xì)胞,建立WT-BAG3、S187A-BAG3、S187D-BAG3穩(wěn)定過表達(dá)FRO細(xì)胞系。
  2、應(yīng)用磷酸化蛋白宮集、二維差異凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)確定PKCδ的底物,并通過Western blot和免疫共沉淀確定PKCδ和

9、BAG3之間的相互作用。體外激酶實(shí)驗(yàn)確定BAG3蛋白的磷酸化位點(diǎn)。
  3、相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并成像,對比各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞形態(tài)的區(qū)別。鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞骨架染色后,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并成像,應(yīng)用專業(yè)軟件測定細(xì)胞長軸、短軸直徑后計(jì)算其比值,對細(xì)胞形態(tài)的變化進(jìn)行定量分析。
  4、應(yīng)用Real-time PCR、Western blot、免疫熒光技術(shù)檢測各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞系中EMT標(biāo)記物E-cadherin、

10、N-cadherin、Vimentin、β-catenin的表達(dá)量及表達(dá)位置變化。
  5、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)、transwell轉(zhuǎn)移小室、三維Matrigel轉(zhuǎn)移小室實(shí)驗(yàn)觀察各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞系中細(xì)胞遷移、侵襲能力的變化。
  6、應(yīng)用PKCδ特定激活劑、抑制劑處理WT-BAG3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞系,觀察腫瘤細(xì)胞侵襲的變化,以探討其可能的機(jī)制。
  結(jié)果:
  1、BAG3是PKCδ的磷酸化底物之一,兩者之間存在一

11、定的相互作用,PKCδ在Ser187位點(diǎn)磷酸化BAG3。
  2、BAG3蛋白Ser187位點(diǎn)磷酸化影響細(xì)胞形態(tài),模擬磷酸化S187D-BAG3穩(wěn)定過表達(dá)FRO細(xì)胞變得狹長,呈紡錘狀,細(xì)胞連接變得松散,形態(tài)更趨于間質(zhì)細(xì)胞;阻礙磷酸化S187A-BAG3穩(wěn)定過表達(dá)FRO細(xì)胞變得立方,細(xì)胞連接緊密,形態(tài)趨于上皮細(xì)胞。
  3、BAG3蛋白Ser187位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)影響FRO細(xì)胞EMT標(biāo)志物的表達(dá)量,S187D-BAG3穩(wěn)定過表達(dá)

12、FRO細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和波形蛋白表達(dá)水平提高,上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)水平下降。S187A-BAG3穩(wěn)定過表達(dá)FRO細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin和波形蛋白表達(dá)水平較低,而上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)水平較高。
  4、BAG3蛋白Ser187位點(diǎn)磷酸化導(dǎo)致FRO細(xì)胞EMT標(biāo)志物的表達(dá)位置變化,免疫熒光結(jié)果顯示S187D-BAG3穩(wěn)定過表達(dá)FRO細(xì)胞中E-cadherin的表

13、達(dá)出現(xiàn)了向核周的內(nèi)化,在WT-BAG3和S187D-BAG3穩(wěn)定過表達(dá)FRO細(xì)胞中可見β-catenin的表達(dá)提高并且向細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了重新分布,尤其在S187D-BAG3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞β-catenin主要表達(dá)在核周。
  5、BAG3蛋白Ser187位點(diǎn)磷酸化影響FRO細(xì)胞的遷移侵襲,坐標(biāo)定點(diǎn)劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)T-BAG3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力提高,S187D-BAG3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞遷移能力進(jìn)一步提高,轉(zhuǎn)移小室實(shí)驗(yàn)同樣

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