HDND-11對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖的影響及其部分作用機(jī)制的研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis, RA）是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥和滑膜異常增生為特點，從而侵蝕鄰近的軟骨和骨組織，最終導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)節(jié)損傷，為人類最常見的自身免疫性疾病之一。
　　大量的實驗指出，異常增殖活化的成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)，可分泌多種炎癥介質(zhì)，從而引起滑膜損傷，是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件。因此，通過抑制 FLS細(xì)胞的活化增殖是

2、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種方法。
　　文獻(xiàn)提示，Wnt信號通路調(diào)節(jié)控制著許多細(xì)胞生物過程，其中包含細(xì)胞的生長、增殖和凋亡等。其中，經(jīng)典的Wnt信號通路在肝癌，宮頸癌，胃癌，黑色素瘤等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了極其明顯的作用。分泌型卷曲相關(guān)蛋白2(SFRP2)是一種細(xì)胞外的一種分泌性蛋白，同時它也是 Wnt信號通路上游的一種拮抗劑。在多種癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，SFRP2在甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）催化下，自身可發(fā)生甲基化而導(dǎo)致其表達(dá)顯著降低

3、，從而激活經(jīng)典的 Wnt信號通路。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中SFRP2是否發(fā)生甲基化從而激活Wnt信號通路促進(jìn)FLS細(xì)胞的異常增殖，還未見文獻(xiàn)報道。
　　越來越多的文獻(xiàn)表明中藥在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療方面起著至關(guān)重要的作用。橙皮素（Hesperidin，HDN）是一種黃酮類化合物，主要存在于柑橘類水果中。它也是傳統(tǒng)中藥陳皮的主要成分。已知黃酮類化合物，包括HDN，具有多種生物學(xué)功能，例如抗炎、抗風(fēng)濕、抗病毒和抗癌等生物活性。因此，本課題

4、組前期合成并改進(jìn)了一些橙皮素衍生物，實驗篩選發(fā)現(xiàn)橙皮素衍生物11(HDND-11)可抑制滑膜細(xì)胞增殖，通過MTT實驗檢發(fā)現(xiàn)HDND-11對FLS細(xì)胞的增殖和活化有顯著地抑制作用，并可促進(jìn)SFPR2的表達(dá)。那么 HDND-11對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是否有治療作用，其作用機(jī)制是否與促進(jìn)SFRP2的表達(dá)有關(guān)，本實驗就此問題進(jìn)行了研究。
　　本課題以AA大鼠模型為對象，研究HDND-11對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用及其可能的作用機(jī)制，實驗分以下6個部

5、分。
　　1、HDND-11對AA大鼠模型的治療作用。
　　雄性SD大鼠通過右后足趾皮內(nèi)注射完全佐劑（CFA），建立AA大鼠模型。通過HE染色、關(guān)節(jié)炎評分、足腫脹評分以及ELISA檢測大鼠關(guān)節(jié)的炎癥程度。實驗結(jié)果表明，HDND-11對關(guān)節(jié)炎具有明顯的治療效果。
　　2、HDND-11抑制大鼠FLS的增殖的研究。
　　通過用MTT方法，檢測0,12.5,25,50,100,200μM六個不同濃度的HDND-11作用

6、FLS細(xì)胞48h以及使用HDND-11（100μM）分別作用FLS細(xì)胞6h,12h,24h和48h,從而判斷HDND-11對FLS細(xì)胞的增殖的影響。此外，采取流式細(xì)胞術(shù)檢測HDND-11對FLS細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期分布的影響。實驗結(jié)果表明，HDND-11能夠顯著地抑制FLS細(xì)胞的增殖。
　　3、HDND-11促進(jìn)AA大鼠滑膜組織和FLS細(xì)胞中SFRP2的表達(dá)的研究。
　　通過用免疫組化、Western blot以及RT-qPC

7、R方法檢測滑膜組織中SFRP2的表達(dá)，用Western blot、 RT-qPCR以及免疫熒光檢測FLS中SFRP2的表達(dá)。實驗結(jié)果表明，與正常組相比較，AA滑膜組織和AA-FLS中SFRP2的表達(dá)顯著降低，且HDND-11能夠顯著促進(jìn)模型組滑膜組織和FLS細(xì)胞中SFRP2的表達(dá)。
　　4、SFRP2對FLS細(xì)胞增殖的研究。
　　鑒于SFRP2在AA-FLS細(xì)胞中低表達(dá)，本文采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)

8、染PEGFP-N1-SFRP2作用于AA-FLS細(xì)胞，用Western blot、 RT-qPCR以及免疫熒光檢測FLS中SFRP2的表達(dá)。實驗結(jié)果表明，SFRP2過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過MTT和流式細(xì)胞術(shù)（FCM）方法檢測過表達(dá)的SFRP2對AA-FLS增殖的影響。實驗結(jié)果表明，過表達(dá)的SFRP2能夠顯著抑制AA-FLS的增殖。
　　5、HDND-11促進(jìn)AA大鼠滑膜組織和FLS細(xì)胞中SFRP2表達(dá)機(jī)制的研究。
　　用We

9、stern blot以及RT-qPCR方法檢測滑膜組織中DNMT1的表達(dá)，用Western blot、 RT-qPCR以及免疫熒光檢測FLS中DNMT1的表達(dá)。實驗結(jié)果表明，與正常組相比較，AA滑膜組織和AA-FLS中DNMT1的表達(dá)顯著升高，且HDND-11能夠顯著抑制模型組滑膜組織和FLS細(xì)胞中DNMT1的表達(dá)。用Western blot和RT-qPCR兩種實驗方法檢測DNMT1對SFRP2蛋白及RNA表達(dá)的影響。實驗結(jié)果表明，沉默

10、DNMT1基因的表達(dá)能夠顯著升高SFRP2基因的表達(dá)。
　　6、HDND-11、SFRP2以及DNMT1對Wnt信號通路的影響。
　　通過Western blot檢測HDND-11對滑膜組織及FLS細(xì)胞中β-catenin, C-myc和cyclinD1的表達(dá)的影響。實驗結(jié)果表明，HDND-11能夠顯著抑制滑膜組織及FLS細(xì)胞中β-catenin, C-myc和cyclinD1的表達(dá)，即HDND-11能夠抑制Wnt信號通路。