炎性關(guān)節(jié)病中成纖維樣滑膜細胞的生物學(xué)特性及致病機制研究.pdf

1、成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs)是炎癥關(guān)節(jié)中重要的效應(yīng)細胞。過去認為其只在對單核和淋巴細胞的應(yīng)答中具有修復(fù)功能，即具有降解和重塑細胞外基質(zhì)的作用；目前認為，F(xiàn)LSs能夠向周圍基質(zhì)細胞和浸潤免疫細胞提供大量的趨化和活化信號，并具有不需要T細胞介導(dǎo)的直接破壞軟骨和骨的能力。體外培養(yǎng)的FLSs能夠釋放多種細胞因子和生長因子，區(qū)別于從非滑膜部位分離的成纖維細胞，具有獨特的生物學(xué)特性。FLSs

2、釋放的效應(yīng)分子能刺激或(在某些情況下)減弱炎癥反應(yīng)，其具有的參與關(guān)節(jié)炎癥的作用正越來越被人們所關(guān)注。 本研究旨在觀察類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎以及強直性脊柱炎患者體外培養(yǎng)的FLSs形態(tài)學(xué)特征及其在靜息和刺激條件下的生長增殖曲線及細胞遷移比率；通過流式細胞術(shù)檢測細胞免疫表型在FLSs的表達和比例；通過實時定量PCR檢測炎性細胞因子mRNA的表達情況以及通過CBA法分析細胞培養(yǎng)上清中分泌的炎癥因子的表達水平，并比較藥物(地塞米松、環(huán)孢素

3、A)對其的影響，從而探討FLSs與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的發(fā)病機制和治療機理。具體分為以下三個部分： 第一部分不同類型關(guān)節(jié)炎FLSs的形態(tài)學(xué)特征及其在靜息和刺激條件下的生長增殖曲線及細胞遷移能力比較 目的： 了解體外原代及傳代培養(yǎng)的源自不同類型關(guān)節(jié)炎患者的FLSs的形態(tài)學(xué)特征，比較其在靜息和刺激條件下的細胞生長增殖特性及細胞的遷移能力。 方法： 選擇骨關(guān)節(jié)炎(OA)13例，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)6例，強直性脊柱

4、炎(AS)2例，關(guān)節(jié)置換術(shù)取滑膜組織或抽取膝關(guān)節(jié)滑液分離FLSs滑膜細胞并培養(yǎng)、傳代。在相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，WST-1法觀察細胞生長曲線以及對脂多糖(LPS)刺激的增殖反應(yīng)，Transwell小室觀察細胞在靜息及LPS刺激下的遷移能力變化。 結(jié)果： OA、RA以及AS患者FLSs細胞在形態(tài)上無明顯差異：原代和早期傳代的貼壁細胞均表現(xiàn)為梭形、星形、多角形、樹突形等形態(tài)上的多樣性，傳代后并密集生長的FLSs細胞形態(tài)逐漸

5、單一純化，多為梭形且大小均一、呈平行樣或漩渦樣排列，滑液來源的細胞中圓形或橢圓型的貼壁細胞占多數(shù)。RA和OA FLSs在傳代后第4天進入對數(shù)生長期，在第7天達到生長平臺期。LPs刺激組于給藥后第2天明顯增殖，第3天增殖達到最高，但在維持LPS濃度的第5天，細胞數(shù)降至比未刺激組更低的水平。培養(yǎng)第3天的RA FLSs與OA FLSs的OD值進行比較有顯著性差異(1.48±0.07 vs0.808±0.12，P＜0.001)?；簛碓吹腁S

6、FLSs細胞生長緩慢，對LPS刺激反應(yīng)不明顯。RA FLSs與OA FLSs在LPS刺激下遷移的細胞數(shù)比對照組有顯著差異(55.58±4.09 vs30.25±1.79，36.10±3.50 vs22.00±2.22，P值均＜0.01)，RA FLSs在刺激后增加的遷移細胞數(shù)與OA FLSs比較也有顯著的差異(25.33±3.86 vs14.11±3.26，P＜0.005)。 結(jié)論： 不同類型炎性關(guān)節(jié)病患者體外培養(yǎng)的FL

7、Ss在光鏡下無明顯形態(tài)學(xué)上的差異；體外培養(yǎng)的RAFLSs具有比較OAFLSs更強的增殖和遷移能力。 第二部分免疫細胞化學(xué)相關(guān)膜分子在FLSs細胞的表達及變化以及胞內(nèi)因子TNFa、IFNy的流式檢測 目的： 通過流式細胞術(shù)篩查FLSs膜分子的免疫細胞化學(xué)特征及TNFα、IFNγ等細胞因子在FLSs細胞的表達情況，檢測在LPS刺激下FLSs細胞亞群的表型和比例變化。 方法： 病例選擇同第一部分。選擇的

8、膜分子抗體染料試劑為：CD3-FITC，CD4-PE，CD8-APC，CD45-Pacific Orange，CD45RO-APC，CD45RA-PE，TCRαβ-PE，TCRγδ-PE；CD19-PE-Cy5，CD14-APC，CD68-FITC，CD11c-PE，HLA-DR-APC；CD2-PE，CD7-FITC，CD16-PE，CD56-PE，CD57-FITC，CD116-Pacific Blue：CD13-PE，CD33-P

9、E，CD34-PE-Cy7，CD38-Percp-Cy5.5，CD44-Pacific Blue，CD69-PE-Cy5，CD90-APC，CD117-PE。胞內(nèi)染色的細胞因子為TNF-α-PacificBlue、IFNγ-PercpCy5.5、IL-4-FITC、IL-17-PE。 結(jié)果： 在篩查的27種表型中，CD13、CD90、CD44呈強陽性表達(分別為98.05±2.18％，96.7±4.8％，88.83±8.

10、2％)。CD34、CD56、HLA-DR呈弱陽性表達，且為獨立的亞群(分別為8.36±2.76％，18.75±13.74％，3.28±2.34％)，其它21種抗體陽性比例均＜0.5％。RA-FLSs(n=6)中CD34+、CD56+、HLA-DR+細胞亞群的比例與OA FLSs(n=13)比較均有顯著差異，其中RA FLSs CD56+、HLA-DR+比例高于OA FLSs(分別為33.65±6.12vs16.80±4.36，7.13±

11、1.85 vs3.75±1.24，P＜0.0001)，而CD34+比例低于OA FLSs(4.34±1.63vs8.89±2.60，P＜0.01)。在LPS刺激2h后，RA FLSs(n=6)CD56+FLSs、HLA-DR+FLSs表達比例較未刺激時明顯增高(分別為47.61±8.35vs33.65±6.12，P＜0.05；26.68±9.47vs7.13±1.85，P＜0.01)，而CD34+FLSs比例則較未刺激時明顯下降(1.9

12、3±0.92vs4.34±1.63，P＜0.01)。2例OA FLSs與1例RAFLSs在LPS刺激后產(chǎn)生少量的TNFα、IFNγ，IL-4與IL-17在各次檢測中均為陰性。 結(jié)論： CD90、CD44、CD13是FLSs的主要分子標(biāo)記，CD56+FLSs、CD34+FLSs、HLA-DR+FLSs亞群可能與滑膜炎癥的調(diào)控相關(guān)，F(xiàn)LSs細胞可在刺激后產(chǎn)生少量TNFα和IFNγ。 第三部分 FLSs細胞IL-6、I

13、L-1β、IL-10 mRNA的表達、培養(yǎng)上清中分泌的炎性細胞因子水平以及不同藥物對其的影響 目的： 在轉(zhuǎn)錄水平觀察FLSs細胞IL-6、IL-1β、IL-10mRNA的表達，并觀察地塞米松(Dex)及環(huán)孢素A(CsA)在LPS刺激2h后對其表達的影響；在蛋白水平檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10、IL-12p70以及TNFα等主要炎性因子的表達以及Dex、CsA在LPS刺激24h后對其分泌的細

14、胞因子的影響。 方法： 提取FLSs總RNA，合成cDNA第一鏈，以β-actin為看家基因，實時熒光定量PCR分析FLSs細胞中IL-6、IL-1β、IL-10mRNA的相對含量，比較LPS刺激前后以及分別加入藥物Dex、CsA后的影響；CBA法檢測FLSs細胞培養(yǎng)上清中分泌的IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10、IL-12p70以及TNFα的水平，并比較LPS刺激前后以及分別加入藥物Dex、CsA后的影響。

15、 結(jié)果： OA和RA FLSs細胞IL-6、IL-1β、IL-10 mRNA在LPS刺激后的表達明顯增加，其中IL-1β mRNA表達最高，IL-6 mRNA次之，加入Dex后，各細胞因子mRNA水平均明顯降低，而加入CsA后降低的程度不如Dex明顯。RA和OA FLSs在靜息狀態(tài)下可分泌低水平的IL-6(分別為1.12±1.05，3.53±3.99 ng/mL)及IL-8(分別為0.15±0.08，0.15±0.07 ng

16、/mL)。在LPS刺激下，IL-6水平增高(分別為42.78±12.49，10.18±3.32 ng/mL)，IL-8水平也增高(分別為23.13±7.25，19.07±9.34 ng/mL)，其中以RA FLSs增高程度更為明顯(P＜0.001)。Dex能夠明顯抑制IL-6的分泌，對IL-8的抑制作用相對較弱，而CsA均僅起到部分的抑制作用。而其它IL-1β、IL-10、IL-12p70及TNFα的含量均為微量或測不出。 結(jié)論