骨橋蛋白在大鼠腦創(chuàng)傷中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行了論述： 第一部分骨橋蛋白(OPN)添加對(duì)大鼠腦創(chuàng)傷影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究OPN添加對(duì)大鼠腦創(chuàng)傷的作用。 方法：1.建立培養(yǎng)大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞離心損傷模型。模型建立后立即分別添加生理鹽水或不同濃度(0.01μg/ml、0.05μg/ml和0.1μg/ml)OPN。分別于傷后24h、48h、72h、120h和168h收集培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2、 2.制作大鼠側(cè)方液壓沖擊(LFP)腦創(chuàng)傷模型，研制大鼠呼吸面罩。大鼠中度LFP腦創(chuàng)傷后24h內(nèi)分別行立體定向腦室內(nèi)注射生理鹽水5μl或OPN5μl(50ng)。于傷后72h、120h和168h分別進(jìn)行大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分、行走和平衡運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)，Morris水迷宮記憶功能評(píng)價(jià)。隨后大鼠行心臟灌注取腦，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)。 結(jié)果：1.添加OPN后神經(jīng)細(xì)胞增殖活躍，凋亡率降低，呈劑量依賴關(guān)系。 2.應(yīng)用面罩呼吸機(jī)輔助呼吸，LF

3、P腦創(chuàng)傷大鼠的死亡率由30％降低到11.84％。 3.腦室內(nèi)注射OPN后LFP腦創(chuàng)傷大鼠水迷宮記憶力、神經(jīng)學(xué)評(píng)分、行走和平衡功能改善。 結(jié)論：OPN可促進(jìn)培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。腦室內(nèi)注射OPN可促進(jìn)腦創(chuàng)傷后大鼠的記憶力和神經(jīng)功能恢復(fù)，呈劑量依賴關(guān)系。 第二部分OPN表達(dá)封閉對(duì)大鼠腦創(chuàng)傷影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究OPN基因沉默對(duì)大鼠腦創(chuàng)傷的影響。 方法：1.用載體TG005構(gòu)建O

4、PN表達(dá)載體：根據(jù)OPN基因信息設(shè)計(jì)并合成引物。提取胎鼠心肌總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR合成目的片段。目的片段經(jīng)Mlul和Spel雙酶切、純化。載體雙酶切，去磷酸化。酶切目的片段和酶切載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒，雙酶切后測(cè)序鑒定命名為TG005-OPN。TG005-OPN與脂質(zhì)體Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)，電泳鑒定。 2.構(gòu)建OPN特異性RNAi慢

5、病毒載體：根據(jù)OPN基因信息設(shè)計(jì)3條shRNA序列：OPN-Sh1：ACGATGATGACGACGACGA，OPN-Sh2：ATGACGACGACGATGACGA，OPN-Sh3：AGCACACAAGCAGACGTTT。合成三對(duì)互補(bǔ)的DNA片段，PCR擴(kuò)增后用BamHI和XhoI雙酶切，純化，載體pRNAi-U6.2/Lenti雙酶切，去磷酸化。酶切DNA片段與酶切載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，篩選陽性克隆，測(cè)序鑒定并命名為L(zhǎng)v-OPN

6、-Sh。 3.慢病毒載體包裝，鑒定：用Lipofectamine2000將慢病毒載體4質(zhì)粒(pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G及Lv-OPN-Sh)轉(zhuǎn)移至293T包裝細(xì)胞，產(chǎn)生重組慢病毒顆粒。重組慢病毒顆粒與TG005-OPN共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，組織蛋白抽提及Western檢測(cè)OPN基因沉默效果。 4.慢病毒重組顆粒轉(zhuǎn)染大鼠創(chuàng)傷神經(jīng)細(xì)胞，檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 5.慢病毒重組顆粒5μl/空載體5μl/

7、生理鹽水5μl/TG005-OPN5μl分別行LFP腦創(chuàng)傷大鼠腦室內(nèi)注射。于傷后72h、120h和168h分別進(jìn)行大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)及記憶功能評(píng)價(jià)。 結(jié)果：1.TG005與目的插入片段連接陽性菌落酶切電泳顯示插入片段約1000bp，該片段測(cè)序并與GenBank中OPN序列比較證明該片段為OPN，OPN表達(dá)載體TG005-OPN制備成功。 2.pRNAi-U6.2/Lenti載體與設(shè)計(jì)合成的3條OPN-shRNA連接，陽性

8、菌落測(cè)序鑒定證明3個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建成功并分別命名為L(zhǎng)v-OPN-Sh(1，2，3)。 3.脂質(zhì)體及慢病毒四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，熒光顯微鏡下見大量綠色熒光，證實(shí)有大量質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。 4.TG005-OPN與慢病毒共轉(zhuǎn)染293T后Western檢測(cè)顯示Lv-OPN-Sh2可明顯抑制OPN表達(dá)。 5.Lv-OPN-Sh2慢病毒重組顆粒轉(zhuǎn)染損傷神經(jīng)細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6.Lv-