冷保存對肝移植后肝內(nèi)膽管微循環(huán)影響及其意義的實驗研究.pdf

1、近年來，隨著肝移植技術(shù)的長足進步，肝移植已成為目前治療眾多嚴重肝病的最佳手段。但是長期以來肝移植后缺血型膽道病變(ITBL)的發(fā)生率一直居高不下，嚴重影響了肝移植病人生存率和生活質(zhì)量，業(yè)已成為阻礙肝移植療效提高的重要因素。對肝移植后ITBL的研究也已引起全球移植專家的廣泛而高度的重視。但是，肝移植后ITBL的病因至今還不甚清楚。膽管上皮細胞被認為是肝臟冷保存及再灌注損傷的敏感靶點。在臨床肝移植中，經(jīng)歷較長時間冷保存的供肝在移植后雖然其肝

2、臟功能能得到良好恢復(fù)，但ITBL的發(fā)生率明顯增加。冷保存再灌注可引起膽管上皮壞死、脫落及纖維化，進一步造成膽泥形成及/或膽道狹窄，這可能是肝移植術(shù)后ITBL發(fā)生的重要原因之一。 近年來，微循環(huán)及其血管內(nèi)皮細胞在冷保存再灌注損傷中的作用越來越引起研究者的重視。肝組織微循環(huán)障礙和肝竇內(nèi)皮細胞受損在肝組織冷保存或缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，是引起肝組織損傷的重要原因之一。肝內(nèi)膽管組織微循環(huán)由膽管周圍血管叢構(gòu)成，充足的圍膽周血管叢血供

3、對維持膽管正常的生理結(jié)構(gòu)和功能極其重要。但是，長期以來，人們對圍膽管血管叢及其內(nèi)皮細胞在膽管冷保存再灌注損傷中的作用認識不夠。迄今為止，國內(nèi)外均未見關(guān)于這方面研究的報道。這主要是因為針對圍膽管血管叢的研究非常困難。在臨床肝移植中，供肝切取時膽管循環(huán)系統(tǒng)灌洗不充分或移植術(shù)后肝動脈血供障礙均會造成膽管組織缺血損傷和移植術(shù)后ITBL的發(fā)生。因此，我們推測圍膽管血管叢及其內(nèi)皮細胞也易受冷保存再灌注損傷，圍膽管血管叢及其內(nèi)皮細胞損傷和與此相關(guān)的膽

4、管組織微循環(huán)障礙可能在肝內(nèi)膽管冷保存再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用，這可能是供肝長時間冷保存易造成肝移植術(shù)后膽管組織嚴重損傷和ITBL發(fā)生的重要原因之一。 肝移植中供肝必將經(jīng)歷冷保存再灌注過程，如何預(yù)防由冷保存再灌注損傷引起的ITBL一直是肝移植研究的熱點和難點。近來的一些研究提示GSNO可能是一種最為理想的NO供體，它在體內(nèi)可以緩慢而持續(xù)地釋放NO，從而可望在缺血再灌注組織中起穩(wěn)定而持久的改善微循環(huán)和減輕組織缺血再灌注損傷的作用

5、。但是，目前已有的研究未涉及膽管組織及其微循環(huán)方面，GSNO是否能改善缺血再灌注后肝內(nèi)膽管的微循環(huán)和減輕膽管缺血再灌注損傷尚不得而知。 本課題進行了以下三部分內(nèi)容的研究： 1、大鼠移植肝膽管冷保存再灌注損傷模型的建立和評價 2、冷保存對肝移植后肝內(nèi)膽管微循環(huán)的影響及其與肝內(nèi)膽管損傷的關(guān)系 3、GSNO對冷保存肝臟移植后肝內(nèi)膽管微循環(huán)和肝內(nèi)膽管損傷的影響 第一部分大鼠移植肝膽管冷保存再灌注損傷

6、 模型的建立和評價 材料與方法 選用體重200～250g雄性的SD大鼠作為實驗動物，共設(shè)三個實驗組：非重建組，采用無肝動脈重建的“二袖套法”施行肝移植；縫合組，肝移植術(shù)中采用Engerman創(chuàng)建的血管縫合方法重建肝動脈；支架組，肝移植術(shù)中采用Gao創(chuàng)建的置入支架的方法重建肝動脈。各組供肝均采用4℃UW液保存24h。另設(shè)假手術(shù)組(ShamOperation,SO)作為正常對照，動物不施行肝移植，開腹后即采集標(biāo)本，共6只大

7、鼠。各實驗組動物于術(shù)后1d、3d和7d分別留取血清和肝組織，每一時相點6對大鼠。另外，每組取12對大鼠觀察肝移植術(shù)后2周受體存活情況。比較各組間肝移植手術(shù)主要步驟時間、術(shù)后2周受體存活情況和膽道并發(fā)癥和肝動脈血栓發(fā)生率。檢測血清ALT、ALP和TBIL的水平。HE染色，光鏡觀察肝組織和肝內(nèi)膽管組織損傷程度并進行半定量評分。采用SPSS10.0軟件包進行統(tǒng)計分析。P＜0.05為相差顯著。 結(jié)論 改良的Gao支架法大鼠

8、原位肝移植是理想的研究移植肝臟膽道冷保存再灌注損傷的動物模型。 第二部分冷保存對肝移植后肝內(nèi)膽管微循環(huán)的影響及其與肝內(nèi)膽管損傷的關(guān)系 材料與方法 實驗動物同第一部分。采用改良Gao法建立重建肝動脈的大鼠肝移植模型。實驗大鼠隨機分為三組：CP1h組，供肝4℃UW液冷保存1h；CP24h組，供肝4℃UW液冷保存24h；SO組，作為正常對照。在供肝冷保存后、術(shù)后1h、6h、1d、3d、7d留取肝組織和血清標(biāo)本，每一時相

9、點6對大鼠。檢測血清ALT、ALP、TBIL水平。HE染色，光鏡觀察肝內(nèi)膽管損傷程度，并行半定量評分。透射電鏡觀察匯管區(qū)膽管上皮細胞及微血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)變化。經(jīng)肝動脈注入直徑101μm的微球，肝組織冰凍病理切片，光鏡下行匯管區(qū)內(nèi)微球計數(shù)。采用間接免疫熒光雙染技術(shù)，檢測匯管區(qū)微小血管內(nèi)皮細胞eNOS、iNOS、ET-1和ICAM-1的表達，并行半定量評分。采用原位雜交技術(shù)檢測匯管區(qū)微小血管內(nèi)皮細胞eNOS、iNOS、ET-1和ICAM

10、-1的mRNA的表達，并行半定量評分。用比色法測定肝組織MPO和NO含量。采用SPSS10.0軟件包中T檢驗和非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計分析。P＜0.05為相差顯著。 結(jié)論 1、大鼠移植肝臟肝內(nèi)膽管易受冷保存再灌損傷，隨冷保存時間的延長肝內(nèi)膽管損傷程度加重。 2、冷保存可引起大鼠移植肝臟肝內(nèi)膽管微循環(huán)及其內(nèi)皮細胞功能和結(jié)構(gòu)明顯改變，隨冷保存時間的延長這種改變進一步加重。 3、冷保存再灌注引起的肝內(nèi)膽管微循

11、環(huán)變化與圍膽管血管叢內(nèi)皮細胞eNOS表達下調(diào)、iNOS、ET-1和ICAM-1表達上調(diào)和內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。 4、微循環(huán)障礙可能在肝內(nèi)膽管冷保存再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用。 第三部分GSN0對冷保存肝臟移植后肝內(nèi)膽管微循環(huán)和肝內(nèi)膽管損傷的影響 材料與方法 實驗動物和大鼠肝移植模型建立與第二部分相同。實驗大鼠隨機分為二組，CP24h組，與第二部分實驗的CP24h組相同；GSNO組，應(yīng)用GSNO預(yù)處理供肝和

12、受體大鼠，其它同CP24h組。手術(shù)方法、觀察時相點、大鼠數(shù)量和標(biāo)本采集、觀測指標(biāo)和檢測方法同第二部分實驗。 結(jié)果 肝功能檢測結(jié)果顯示：與CP24h組比，GSNO組大鼠肝移植術(shù)后所有時相點的ALT和ALP水平均顯著降低(P＜0.05)，TBIL水平在術(shù)后3d和7d也顯著降低。組織病理學(xué)觀察及評分結(jié)果顯示：兩組肝內(nèi)膽管組織損傷在冷保存后無明顯差異；與CP24h組比，GSNO組肝內(nèi)膽管結(jié)構(gòu)受損、匯管區(qū)炎細胞浸潤和總的膽管損傷程

13、度在術(shù)后所有時相點均明顯減輕，膽管增生在術(shù)后3d和7d也明顯減輕(P＜0.05)。電鏡觀察結(jié)果顯示：肝移植術(shù)后，GSNO組肝內(nèi)膽管上皮細胞和血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)改變較CP24h組更輕。微球計數(shù)結(jié)果顯示：GSNO組不同部位肝組織匯管區(qū)內(nèi)微球數(shù)量在所有時相點均較CP24h組顯著減少(P＜0.05)。免疫熒光雙染檢測及評分結(jié)果顯示：與CP24h組比，GSNO組匯管區(qū)微小血管內(nèi)皮細胞eNOS表達在冷保存后無明顯差異，在術(shù)后各時相點均明顯增強(P＜0

14、.05)；iNOS表達在冷保存后無明顯差異，在術(shù)后各時相點均明顯減弱(P＜0.05)；ET-1表達在各時相點均明顯減弱(P＜0.05)；ICAM-1表達在冷保存后和術(shù)后3d無明顯差異，其余時相點均明顯減弱(P＜0.05)。原位雜交檢測及評分結(jié)果顯示：它們的mRNA表達變化與免疫熒光雙染檢測顯示的它們的蛋白質(zhì)表達變化基本一致。與CP24h組比，GSNO組肝組織MPO含量在冷保存后無明顯差異，在術(shù)后各時相點均明顯降低(P＜0.05)；GSN

15、O組肝組織NO含量在各時相點均明顯升高(P＜0.05)。 結(jié)論 1、GSNO治療能明顯改善大鼠移植肝冷保存再灌注后肝內(nèi)膽管組織微循環(huán)狀況。 2、GSNO對肝內(nèi)膽管組織微循環(huán)的影響與GSNO在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的NO、GSNO上調(diào)eNOS和下調(diào)ET-1、iNOS及ICAM-1的表達有關(guān)，也與GSNO減輕微血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。 3、GSNO通過改善肝內(nèi)膽管微循環(huán)間接對肝內(nèi)膽管冷保存再灌注損傷起明顯的保護作用。