骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性腎缺血再灌注損傷的研究.pdf

1、背景及目的：
　　 急性腎功能衰竭（Acuterenalfailure，ARF）是多種原因引起的腎功能驟然下降而出現(xiàn)的臨床綜合征，病死率很高，目前除了支持治療和血液透析，尚沒(méi)有有效的治療方法，是臨床治療的難點(diǎn)。臨床ARF的最常見(jiàn)病因是缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷，腎臟手術(shù)、腎移植及彌散內(nèi)血管性出血均可引起腎臟缺血再灌注損傷，其最主要的病理?yè)p害為急性腎小管壞死（acutetubularnecr

2、osis，ATN）。因此，如何減輕腎小管的壞死、恢復(fù)腎小管的結(jié)構(gòu)和功能是治療ARF的重要切入點(diǎn)。
　　 干細(xì)胞是一群未分化的細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能。骨髓中有兩種干細(xì)胞，即造血干細(xì)胞（Hematopoieticstemcells，HSCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesen-chymalstemcells，MSCs）。造血干細(xì)胞可分化成為不同類型的血細(xì)胞，骨髓MSCs存在于骨髓間質(zhì)，為造血干細(xì)胞提供造血支持，并能分化成間質(zhì)細(xì)胞，

3、如軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。另外，干細(xì)胞可塑性研究證明，骨髓MSCs不僅可以向中胚層細(xì)胞分化，還可以向內(nèi)胚層和外胚層細(xì)胞分化?；诠撬鐼SCs的這些特性，它已成為組織工程學(xué)的一種重要“種子”細(xì)胞。研究報(bào)道，骨髓MSCs能夠歸巢到組織受損區(qū)域，參與修復(fù)損傷的組織，并能改善其功能。在心臟疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，骨髓MSCs移植均起到了明顯的治療療效。
　　 依據(jù)骨髓MSCs的生物學(xué)特性及其在多種損傷性疾病的治療效果，我們認(rèn)為骨髓

4、MSCs移植治療腎損傷疾病可能有效。本研究通過(guò)體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增獲得骨髓MSCs，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)，確定所得細(xì)胞確為骨髓MSCs。同時(shí)建立了小鼠急性腎缺血再灌注損傷模型，經(jīng)尾靜脈注射移植入骨髓MSCs，于移植后的不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)腎功能指標(biāo)（BUN，Scr）、腎臟病理及腎小管上皮細(xì)胞的增殖指數(shù)等指標(biāo)，評(píng)價(jià)骨髓MSCs在小鼠急性腎缺血再灌注模型中的療效，并初步從減輕炎癥反應(yīng)的角度探討骨髓MSCs的治療機(jī)制。
　　 材料與方法

5、：
　　 選擇18-20g（6-8周齡）的BALB/c（H-2Kd）小鼠，雄性小鼠用來(lái)制備骨髓MSCs，雌性小鼠用來(lái)建立動(dòng)物模型。采用全骨髓培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增骨髓MSCs。90只雌性小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、I/R組和MSCs治療組。MSCs治療組和I/R組小鼠采用微血管夾夾閉雙側(cè)腎蒂40分鐘，1小時(shí)后，經(jīng)尾靜脈注射1×106個(gè)骨髓MSCs（0.2ml）或等劑量的RPMI1640。假手術(shù)組只對(duì)其進(jìn)行手術(shù)操作，不夾閉腎蒂。再灌注后

6、第1天、3天、10天和130天時(shí)收集血樣，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清肌酐和尿素氮。部分小鼠于再灌注后第3天和第30天時(shí)處死，取雙側(cè)腎臟進(jìn)行HE染色，根據(jù)Paller標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腎臟的病理改變進(jìn)行評(píng)分。另一部分小鼠于再灌注后第1天和第10天時(shí)處死，取雙側(cè)腎臟進(jìn)行PCNA（ProliferatingCellNuclearAntigen，增殖細(xì)胞核抗原）免疫組化染色，以PCNA陽(yáng)性的腎小管細(xì)胞數(shù)反應(yīng)腎小管上皮細(xì)胞的增殖指數(shù)。
　　 結(jié)果：

7、
　　 1.小鼠骨髓MSCs呈成纖維細(xì)胞樣，免疫標(biāo)記：CD29+、CD44+、CD105+、Flk-1+、CD13-、CD31-、CD34-、CD45-、CD106-、HLA-DR-。
　　 2.小鼠骨髓MSCs在特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中可定向分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 3.成功建立小鼠急性腎缺血再灌注損傷模型，成功率95％。
　　 4.與假手術(shù)組對(duì)比，I/R組再灌注后第1、3天的血清BUN值、

8、Scr值明顯增高（P<0.05），第10、30天的血清BUN值、Scr值無(wú)明顯改變（P>0.05）；MSCs治療組再灌注后第1天的血清BUN值、Scr值明顯增高（P<0.05），第3、10、30天的血清BUN值、Scr值無(wú)明顯改變（P>0.05）。與I/R組對(duì)比，MSCs治療組再灌注后第1天和第3天血清BUN值、Scr值明顯降低（P<0.05）。小鼠MSCs治療組的腎功能恢復(fù)較早。
　　 5.光鏡下觀察MSCs治療組的腎臟病理改

9、變較UR組明顯減輕。I/R組和MSCs治療組再灌注后第3、30天時(shí)的腎臟HE評(píng)分顯示，MSCs治療組的評(píng)分均較I/R組明顯減低（P<0.05）。
　　 6.與假手術(shù)組對(duì)比，I/R組再灌注后第3天的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)沒(méi)有明顯變化（P>0.05），第10天的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增高（P<0.05）；MSCs治療組再灌注后第3天PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增高（P<0.05），第10天的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)沒(méi)有明顯變化（P>0.05）。與I

10、/R組對(duì)比，MSCs治療組再灌注后第3天的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于I/R組（P<0.05），第10天的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于I/R組（P<0.05）。MSCs治療組腎小管上皮細(xì)胞的分化增值較I/R組明顯提前。
　　 結(jié)論：
　　 1.小鼠骨髓MSCs具有多系分化潛能，體外誘導(dǎo)可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 2.成功建立小鼠急性腎缺血再灌注損傷模型。
　　 3.小鼠骨髓MSCs移植可改善急性腎缺