缺血后適應(yīng)基礎(chǔ)上骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠移植肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、第一部分改良三袖套法建立大鼠左肺原位移植動(dòng)物模型
　　 目的:采用改良袖套法技術(shù)建立大鼠同種異體左肺移植模型。方法：對供肺獲取、套管制作、自體肺切除、血管和氣管袖套套接技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。30例清潔級(jí)SD大鼠左供肺獲取后置于4℃的LPDG液保存3小時(shí)，隨后行肉眼直視下同種異體左肺移植術(shù)，再灌注4h后阻斷右肺門，分別測定阻斷前后氣道壓力、動(dòng)脈血?dú)庾兓?、肺?干重比率及光鏡下肺組織結(jié)構(gòu)變化。評價(jià)該模型復(fù)制移植物缺血再灌注損傷的能力。結(jié)果：

2、同種異體左肺移植模型在肉眼直視下單人完成，供受體動(dòng)靜脈和支氣管套管吻合時(shí)間分別為：肺動(dòng)脈(5±1)min、肺靜脈(9±4)min、支氣管(2±0.5)min?？偸中g(shù)時(shí)間(59±10)min。手術(shù)成功率90％(27/30)，術(shù)后生存率100％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該模型成功復(fù)制出同種異體肺移植缺血再灌注損傷的變化。結(jié)論：本模型符合大鼠肺移植模型建立的優(yōu)點(diǎn)，全部操作在肉眼直視下單人完成；供肺的獲取較為快速，使用的套管更簡單，套管技術(shù)趨于簡化，肺移植

3、時(shí)血管套接技術(shù)成功率高，整體手術(shù)時(shí)間操作縮短。該模型復(fù)制出移植肺缺血再灌注損傷的變化，是適合肺移植缺血再灌注損傷研究的理想模型。
　　 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定、標(biāo)記及其對大鼠移植肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　 目的：分離、培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，觀察BMSCs對大鼠左肺移植物缺血再灌注損傷的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。方法：以SD大鼠為供受體，采用改良袖套法技術(shù)建立同種異體左肺

4、移植模型。設(shè)立假手術(shù)組(A組)、I/R組(B組)和BMSCs組(C組)，每組n=7，離體供肺靜脈4℃的LPDG液逆行灌注，灌注后行左肺原位移植，移植肺再灌注4h后，阻斷右肺門，測量氣道壓力，動(dòng)脈血PaO2、PaCO2。隨后處死大鼠，分別測定：肺W/D比率、肺組織中SOD活性、MDA含量、MPO活性；光鏡觀察移植物病理組織學(xué)變化；RT-PCR和Western-blot了解旁分泌因子VEGF的表達(dá)：ELISA檢測受鼠血漿中TNF-a和IL-

5、10的變化；免疫組化檢測TNF-a和bcl-2表達(dá)情況；TUNEL法檢測移植肺細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，I/R組氣道壓力升高、Pa02下降、肺W/D比率上升，SOD活性降低，MDA含量和MPO活性升高(P＜0.01)，表明I/R組相對于假手術(shù)組確實(shí)造成了明顯的缺血再灌注損傷；與I/R組相比，BMSCs組氣道壓力降低、PaO2上升、肺W/D比率下降，SOD活性增高，MDA含量和MPO活性下降(P＜0.01)：與I/R組相比，BM

6、SCs組：血漿TNF-a水平降低，IL-10水平升高；病理檢查肺泡間質(zhì)水腫明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，肺泡腔內(nèi)水腫液和紅細(xì)胞少見；免疫組化TNF-a表達(dá)減弱、bcl-2表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)；TUNEL法檢測移植肺細(xì)胞凋亡減少(P＜0.01)。基因和蛋白水平檢測顯示BMSCs組肺組織旁分泌因子VEGF較假手術(shù)組、I/R組明顯升高(P＜0.01)。結(jié)論：(1)氧化損傷等指標(biāo)檢測表明I/R組確實(shí)復(fù)制了移植肺的IRI：BMSCs移植能減輕移

7、植肺的缺血-再灌注損傷。(2)BMSCs通過其抗氧化、抗炎、抗凋亡和旁分泌效應(yīng)等抗損傷、促組織修復(fù)等多種途徑明顯減輕移植肺缺血再灌注損傷，提高肺移植術(shù)后早期肺功能。因此BMSCs移植可成為預(yù)防和減輕肺移植術(shù)后缺血再灌注損傷的一種有益嘗試。
　　 第三部分缺血后適應(yīng)基礎(chǔ)上骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠移植肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　 目的：觀察缺血后適應(yīng)(I-postC)基礎(chǔ)上BMSCs移植對大鼠同種異體左肺移植物缺血再灌

8、注損傷的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。方法：以SD大鼠為供受體，采用改良三袖套法技術(shù)建立同種異體左肺移植模型。設(shè)立I/R組(A組)， I-postC組(B組)，BMSCs組(C組)和I-postC+BMSCs組(D組)，每組n=14，離體供肺靜脈4℃的LPDG液逆行灌注，灌注后行左肺原位移植，移植肺再灌注4h和72h后，分別隨機(jī)抽取大鼠7只阻斷右肺門，測量氣道壓力，動(dòng)脈血PaO2、PaCO2。隨后處死大鼠測定：肺W/D比率、肺組織中SOD活

9、性、MDA含量、MPO活性；光鏡觀察移植物病理組織學(xué)變化；RT-PCR和Western-blot了解旁分泌因子VEGF的表達(dá)；ELISA檢測受鼠血漿中TNF-a、IL-10、G-CSF和GM-CSF的變化；免疫組化檢測TNF-a和bcl-2表達(dá)情況；TUNEL法檢測移植肺細(xì)胞凋亡水平。免疫熒光法檢測肺組織中BMSCs的定位情況。結(jié)果：基因和蛋白水平檢測顯示單純BMSCs組、I-postC+BMSCs組肺組織旁分泌因子VEGF表達(dá)較I/R

10、組、I-postC組明顯升高(P＜0.01)；G-CSF，GM-CSF(72h)明顯升高(P＜0.01)。與I/R組比較，I-postC組、BMSCs組、I-postC+BMSCs組：TNF-a明顯降低，IL-10明顯升高(P＜0.01)；氣道壓力降低、PaO2上升、肺W/D下降、SOD活性增高、MDA含量和MPO活性下降(P＜0.01)；bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，TUNEL法檢測移植肺細(xì)胞凋亡減少(P＜0.01)。與I/R組、I-postC

11、組、BMSCs組相比，光鏡檢查I-postC+BMSCs組肺泡間質(zhì)水腫減輕最顯著，炎性細(xì)胞浸潤、肺泡腔內(nèi)水腫和滲出改變減輕最明顯。免疫熒光法檢測72h取的肺組織，BMSCs在肺組織中定位，主要分布在肺細(xì)支氣管壁周圍。結(jié)論：在I-postC的基礎(chǔ)上，再行BMSCs移植，減輕移植肺缺血再灌注損傷的程度最顯著。I-postC基礎(chǔ)上BMSCs移植減輕移植肺IRI、提高肺移植術(shù)后早期肺功能的機(jī)制與其抗氧化、抗炎、抗凋亡、旁分泌效應(yīng)和干細(xì)胞歸巢等密